一种中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因及其克隆方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因及其 克隆方法。
【背景技术】
[0002] 多不饱和脂肪酸(PUFA)是生物膜结构的重要组成部分，同时对人类的健康也具有 重要作用，膳食中摄入的PUFA对心律失常有抑制作用，并且PUFA对心血管疾病的辅助治疗 和预防也发挥了一定作用。此外，LC-PUFA与人体的健康更加密切相关，如二十二碳六烯酸 (DHA)可关系到胎儿的生长，发育，某些LC-PUFA还可以降低炎症、癌症及心脑血管疾病的发 病率等。
[0003] 当前常见的多不饱和脂肪酸EPA和DHA的来源主要是深海鱼油，然而随着市场需求 的迅速增长和海洋可捕捞鱼类资源的日益减少，该途径已经远远不能满足需要。此外环境 污染等原因致使鱼油中的重金属含量越来越高。因此，寻找更为持续稳定的EPA和DHA来源 已经成为当务之急。探索利用转基因技术，例如使转基因的物种成为"绿色工厂"，稳定、高 效地生产EPA和DHA是一个重要途径。
[0004] 脂肪酸去饱和酶(Fatty acid desaturase，FAD)是生物体合成PUFA的关键酶，可 催化饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸酰基链上的双键的形成，使脂肪酸不饱和程度得以提高。 目前已知的多不饱和脂肪酸合成的过程示于图5中，其中delta6去饱和酶是PUFA合成过程 中的限速酶，能够催化饱和脂肪酸的第一步去饱和过程，它催化亚油酸(LA)生成γ-亚油酸 (GLA)，以及催化α-亚麻酸(ALA)生成十八碳四稀酸(stearidnoic acid)，它们是ΕΡΑ及其后 DHA生成的关键酶。目前研究已经从秀丽隐杆线虫、小鼠、斑马鱼、虹鳟、军曹鱼、大西洋鲑 鱼、鲈鱼、鲍鱼、金头鲷鱼等中克隆到delta6去饱和酶基因，但是目前有效利用于转基因物 种的商业化应用的delta6去饱和酶数量不多，且选择范围小，因此继续克隆并筛选具有较 高底物专一性和催化活性的delta6去饱和酶使当前的研究热点之一。
[0005] 中华绒螯蟹由于其肉味鲜美，营养丰富，深受广大群众的喜爱，是目前水产养殖中 的经济养殖物种。其肝胰腺中脂肪含量达50%，脂肪对中华绒螯蟹的生长和性腺发育具有 重要的作用，其中EPA和DHA等PUFA是中华绒螯蟹等蟹类所必需的脂肪酸，因此探索中华绒 螯蟹PUFA合成酶的功能具有较大的现实意义。
[0006] 本发明通过对中华绒螯蟹de 1 ta6去饱和酶基因的克隆、基因的序列分析，对该去 饱和酶基因在中华绒螯蟹中的可能作用机制进行了初步探索，为中华绒螯蟹PUFA的合成以 及转基因研究开发，例如利用转基因物种稳定、高效地生产PUFA所必须的去饱和酶基因，提 供了一个基础。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因。
[0008]本发明的另一目的是提供一种中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因编码的蛋白。
[0009] 本发明的另一目的是提供一种中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因的克隆方法。
[0010] 为了实现上述目的可通过以下技术方案实现：
[0011] (1)根据Genebank中华绒螯蟹和菁夜蛾的delta6去饱和酶基因进行对比，获得的 保守序列，设计保守区序列引物FAD6-F1( + )和FAD6-R1(-)，以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转 录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应，获得delta6去饱和酶基因片段核心片段，将所 述核心片段克隆到载体上并测序，
[0012] FAD6-F1( + )的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，FAD6-R1(-)的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；
[0013] ⑵根据获得的delta6去饱和酶基因核心片段设计5'和3'RACE引物FAD6-5'（_)和 FAD6-3 '（ + )，以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的5'-cDNA和3'-cDNA第一链为模板，进 行RACE反应，获得5'和3'末端片段，将获得的末端片段分别连接至载体后克隆并测序，
[0014] FAD6-5'（_)的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示，FAD6-3'（ + )的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
[0015] (3)将5'和3'末端片段分别与核心片段进行拼接得到delta6去饱和酶基因全长序 列。
[0016] 在本发明的一个优选实施例中，步骤（1)和(2)中总RNA是从中华绒螯蟹肝胰腺中 通过Trizol法提取得到的。
[0017] 在本发明的一个优选实施例中，步骤(1)和(2)中所述载体是pGEM-Τ质粒。
[0018]本发明还提供一种载体，其包括中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因。
[0019 ]本发明还提供一种转染细胞，其包括上述载体。
[0020] 本发明还提供一种转染细胞，其表达上述蛋白。
[0021] 在本发明的一优选实施例中，该转染细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、金斯 瑞酵母等中的一种，优选为大肠杆菌。
[0022] 与现有的去饱和酶基因相比，本发明的基因具有以下特点：
[0023] 本发明得到的中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因 cDNA的全长序列包括183bp的5' UTR区域、1326bp的0RF和801bp的3 ' UTR区域，共编码442个氨基酸，其中3 ' UTR区域具有典型 的加尾信号AATAAA及po lyA尾。
[0024]本发明首次报道从中华绒螯蟹中分离克隆了delta6去饱和酶基因，并且首次通过 构建表达载体来验证该基因的功能，并证实了该基因能在大肠杆菌表达系统中稳定表达， 且后续蛋白水平上的研究表明，该基因编码的蛋白具有能够将LA和ALA分别转化为γ-亚麻 酸和十八碳四烯酸的活性，从而为ΕΡΑ和DHA等PUFA的合成奠定了底物基础，为进一步研究 中华绒螯蟹PUFA的合成提供了一定的依据。
[0025] delta6去饱和酶基因编码的蛋白质的氨基酸序列包括:三个组氨酸簇保守区、一 个细胞色素 b5结构域以及血红素结合域HPGG，delta6去饱和酶基因编码的氨基酸还含有四 次跨膜结构域。经过序列比对，发现得到的中华绒螯蟹delta6去饱和酶与NCBI上已报道的 中华绒螯蟹、罗非鱼、尖吻鲈、大西洋鲑、虹鳟、菁夜蛾及小鼠等物种的delta6去饱和酶氨基 酸相似性在40%_76%内。
[0026]使用MAGE对上述物种delta6去饱和酶基因相关氨基酸序列构建系统进化树，结果 如图3所示。中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因与菁夜蛾聚为一支，其余物种聚为一大支。
【附图说明】：
[0027]图1显示了中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因的核苷酸序列。
[0028]图2显示了中华绒螯蟹的delta6去饱和酶的氨基酸序列。
[0029]图3显示了中华绒螯蟹与其它物种delta6去饱和酶基因氨基酸序列比对。
[0030]图4显示了中华绒螯蟹delta6去饱和酶与其它物种FAD6氨基酸序列系统进化树。 [0031]图5显示了目前已知的多不饱和脂肪酸合成的过程。
[0032]图6-a显示了未加底物(亚油酸和α-亚麻酸)的BL21/pC〇ld_fad6菌株脂肪酸图谱。 [0033]图6-b显示了空载体BL21/pCold菌株脂肪酸图谱。
[0034]图6-c显示了加亚油酸的BL21/pC〇ld-fad6菌株脂肪酸图谱，其中1表示亚油酸，2 表示γ-亚麻酸）。
[0035] 图6-d显示了加 α-亚麻酸的BL21/pCold_fad6菌株脂肪酸图谱，其中1表示α-亚麻 酸，2表示十八碳四烯酸。
【具体实施方式】
[0036]以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限 定。
[0037] 实施例1
[0038] 克隆中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因
[0039] (1)根据Genebank中华绒螯蟹和菁夜蛾的delta6去饱和酶基因进行对比，获得的 保守序列，设计保守区序列引物FAD6-Fl( + )(其核苷酸序列如SEQ ID勵:3)所示和?六06-1?1 (_)(其核苷酸序列如SEQ ID N0:4)，以Trizol法提取的中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合 成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应，获得delta6去饱和酶基因核心片段。PCR加样体系为 cDNA模板 1.0yL，dNTP Mixture 4.0yL，两种引物（ΙΟμΜ)各0.5yL，10XPCR Buffer(Mg2+ Plus)2·5yL，rTaq E(5U/yL)0·25yL，ddH20 16·25μΙ^ΡΟ?条件为94°C预变性5min，后进行30 个循环，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循环结束后再72°C延伸lOmin。获得的中 华绒螯蟹Elovl6基因核心片段克隆到pMD-19T载体并测序。
[0040] (2)根据获得的delta6去饱和酶基因核心片段设计5'和3'RACE引物FAD6-5'（-) (其核苷酸序列如SEQ ID N0:5)和FAD6-3'（ + )(其核苷酸序列如SEQ ID N0:6)。以Trizol法 提取的中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成5 ' -cDNA和3 ' -cDNA第一链，分别以此cDNA为模 板，进行RACE反应，获得5 '和3 '末端片段。将获得的末端片段分别连接至载体后克隆并测 序。
[0041 ] 5'-RACE反应体系为5' -cDNA模板2 · 5yL，ΙΟμΜ的5'-RACE引物0.5以1^，10\1]?]\1(5'- CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'）5.0yL，10mM dNTP Mix 1.0yL，50XAdvantage 2Polymerase Mix 1.0yL，10XAdvantage 2PCR buffer缓冲液5.0yL，加灭菌去离子水至总体积50yL。反 应条件：94°C30s，72°C2min，5 个循环；94°C30s，70°C30s，72°C2min，5 个循环；94°C30s，68°C 30s，72°C2min，28 个循环；72°C 10min。
[0042] 3 ' -RACE反应体系为3 ' -cDNA 模板2 · 5yL，10μΜ的 3 ' -RACE引物0.541^，10\1]卩]\1(5'- CTAATACGACTCACTATAGGGC-3,)5.0yL,10m M dNTP Mix 1.OyL,50X Advantage 2Polymerase Mix 1.