环状RNA circ-ZKSCAN1的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种环状RNA，具体涉及一种环状RNA circ-ZKSCANl的用途。
【背景技术】
[0002] 原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称肝癌)是全球范围内 最常见的恶性肿瘤之一。全球每年约有74万患者被新诊断为肝细胞癌，同时约有69万患者 死于肝癌。其中我国占到了全球每年新发病例的55%，成为全世界肝癌最高发的地区之一。
[0003] 迄今，以手术治疗为核心的综合治疗仍然是原发性肝癌患者获得长期生存的唯一 希望，但是目前肝癌治疗状况存在早期诊断困难，手术根治率低、复发率高、预后差的困扰。 主要原因之一是早期诊断困难，AFP作为唯一被广泛接受用于肝癌诊断或检测的血清学标 记物，其诊断肝癌的敏感度只能达到约50%，众多因素最终导致超过70%的患者在首次就 诊时便已进入肝癌晚期，从而丧失了包括手术切除或肝移植的外科根治性治疗的机会。故 深入研究肝癌发生和发展中的分子机制、开发新的诊断标志物和治疗靶点成为当前肿瘤研 究的热点和重点领域。
[0004] 环状RNA(ciucular RNA，circRNA)是区别于传统线性RNA的RNA家族新成员，不具 有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。最新研 究表明circRNA具有闭合环状结构，主要通过非典型可变剪切加工产生，广泛存在于各种生 物细胞中，具有结构稳定，难以被RNA酶降解、表达丰度高、物种间保守性好，表达具有组织 及时空特异性等特征，这些特点使得circRNA在新型疾病诊断与治疗方法的开发应用上具 有广阔的前景。
[0005] Circ-ZKSCANl(CircBase ID:hsa_circ_0001727)，其在基因组上的定位为：chr7: 99621041-99621930,相应的线性基因为ZKSCAN1(NM_003439)，环化序列有668个碱基，包含 ZKSCAN1基因的第二和第三个外显子。有报道ZKSCAN1能促进胃癌的侵袭和转移，但在肝癌 中没有研究。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于根据发明人对环状RNA circ-ZKSCANl在人肝癌中的表达及其 对肝癌细胞生物学功能的调节作用的研究，提供基于circ-ZKSCANl基因及其表达产物在肝 癌的诊断和治疗方面的用途。
[0007] 为实现上述目的，所采取的技术方案：一种环状RNA circ-ZKSCANl，所述环状RNA circ-ZKSCANl的核苷酸序列如SEQ ID N0:14所示。所述环状RNA circ-ZKSCANl的结构是由 如SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列首尾连接成的环状结构。
[0008] 本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1所述的环状RNA circ-ZKSCANl〇
[0009] 本发明提供了一种肝癌诊断试剂盒，所述试剂盒包含能够扩增上述所述的环状 RNA circ-ZKSCANl的引物。
[0010] 优选地，所述扩增引物为由如SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示的DNA序列组成的 引物对或由如SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5所示的DNA序列组成的引物对。
[0011] 本发明提供了上述所述的环状RNA circ-ZKSCANl在制备治疗肝癌的药物中的用 途。
[0012] 本发明提供了 circ-ZKSCANl基因作为靶基因在制备治疗肝癌的药物中的用途，所 述circ-ZKSCANl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。。
[0013] 本发明提供了 circ-ZKSCANl基因激活剂在制备治疗肝癌的药物中的用途，所述 circ-ZKSCANl基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。。
[0014] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0015] ⑴本发明首先通过设计特异的环状RNA引物进行RT-PCR、一代测序、RNA酶降解实 验证实circ-ZKSCANl基因的客观存在；
[0016] (2)本发明通过检测肝癌病人中circ-ZKSCANl基因表达情况，发现其表达水平明 显降低，因此，可作为肝癌的诊断标志；
[0017] (3)本发明对circ-ZKSCANl基因进行了体外细胞功能学的研究，通过将circ-ZKSCAN1基因序列特异性shRNA序列转染到SMMC-7721肝癌细胞系，以建立该基因表达下调 的细胞株。转染了circ-ZKSCANl基因 shRNA序列的肝癌细胞与转染空载体的对照肝癌细胞 相比，其增殖速度、细胞迀移率及细胞侵袭能力等均显著升高。circ-ZKSCANl基因及其表达 产物可以应用在制备治疗肝癌的药物中。
[0018] circ-ZKSCANl基因及其表达产物作为诊断肝癌的标志物，使肝癌诊断更加准确、 快速，作为制备治疗肝癌药物的靶基因为治疗肝癌提供了新的治疗靶点和治疗途径。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明实施例1中circ-ZKSCANl的结构示意图；
[0020] 图2为本发明实施例1中circ-ZKSCANl基因表达产物的琼脂糖凝胶电泳图；
[0021]图3为本发明实施例1中circ-ZKSCANl环化位点的测序峰图；
[0022] 图4为反映本发明实施例2中RNaseR对circ-ZKSCANl和GAPDH影响情况的柱状图。
[0023] 图5为本发明实施例2中QPCR检测肝癌组织中circ-ZKSCANl表达结果对比图；
[0024] 图6为本发明实施例3中构建好的稳定细胞株荧光显微镜图；
[0025] 图7为本发明实施例3中SMMC-7721-sh circ-ZKSCANl细胞株表达circ-ZKSCANl的 结果对比图；
[0026]图8为本发明实施例4中circ-ZKSCANl表达下调的肝癌细胞株生长速度加快。
[0027]图9为本发明实施例5中circ-ZKSCANl表达下调的肝癌细胞株迀移率增加。在肝癌 细胞SMMC-7721中特异干扰circ-ZKSCANl基因后的细胞迀移实验结果示意图，其中横坐标 为天数，纵坐标为发生迀移的细胞数目。
[0028]图10为本发明实施例6中circ-ZKSCANl表达下调的肝癌细胞株侵袭能力加强。在 肝癌细胞SMMC-7721中特异干扰circ-ZKSCANl基因后的细胞侵袭实验结果示意图，其中横 坐标为天数，纵坐标为发生侵袭的细胞数目。
【具体实施方式】
[0029] 本发明首先通过设计能扩增环状RNA的特异性引物，PCR扩增出来ZKSCAN1基因的 环状RNA，并通过一代测序的方法测定出来了环状RNA circ-ZKSCANl的准确的环化位点，接 着进行RNaseR降解实验，确定了ZKSCAN1基因表达一种由668个核苷酸组成的，具有闭合环 状结构的环状RNA分子，本发明所述环状RNA circ-ZKSCANl的结构示意图如图1所示。
[0030] 进一步，本发明通过采用荧光定量PCR的方法检测circ-ZKSCANl基因在肝癌样本 中的表达差异，结果显示circ-ZKSCANl基因在肝癌组织中的表达水平明显低于癌旁组织中 的表达水平。故可制作检测该基因表达变化的试剂盒以用于诊断肝癌。
[0031] 接着，我们对circ-ZKSCANl基因进行了体外细胞功能学的研究，通过将circ-ZKSCAN1基因序列特异性shRNA序列转染到SMMC-7721肝癌细胞系，以建立该基因表达下调 的细胞株。转染了circ-ZKSCANl基因 shRNA序列的肝癌细胞与转染空载体的对照肝癌细胞 相比，其增殖速度、细胞迀移率及细胞侵袭能力等均显著升高。因此，circ-ZKSCANl基因及 其表达产物可以应用在制备治疗肝癌的药物中。
[0032]本发明所涉及的技术均为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、试剂以及 反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试 剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知 并熟练掌握。
[0033]下面通过实施例和试验例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对 本发明的限制。
[0034] 实施例1 :RT-PCR反应检测circ-ZKSCANl基因在肝癌组织中的表达。
[0035]具体实验方案如下：
[0036] 1.RNA 提取
[0037] 1)组织处理：取10mg左右组织加入lmlTrizol，用匀浆机匀浆；离心15分钟， 12000g，取上清。
[0038] 2)向上清中加入200ul氯仿，上下用力颠倒混匀半分钟，静置3分钟。
[0039] 3)4°C，12000g离心15分钟，此时可见裂解液分三层：上层为水相的RNA;中层为 DNA，脂类等;下层为细胞残渣，蛋白，多糖等。
[0040] 4)取上清到新的EP管内；加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟后，4°C，12000g 离心10分钟。
[00411 5)小心去掉上清，注意不要丢失RNA沉淀，加入lml 75%乙醇，上下颠倒，使沉淀块 重悬起。
[0042] 6)4°C，12000g离心10分钟，小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失 RNA沉淀，若沉淀松动可再次离心。晾干约15分钟，至管壁无液体。
[0043] 7)加入适量体积(20-30ul)的DEPC水溶解RNA，58°C水浴10分钟。
[0044] 8)取出2ul定量，测量buffer: 10mM TrisCl(pH7.8)，根据定量结果进行逆转录。 (1A260 = 40μg/ml，A260/A280 = 1·8~2·1)。
[0045] 2.cDNA 逆转录
[0046] D实验体系
[0047] M-MLV Reverse Transcriptase：
[0049] 3.引物:环状RNA引物为反向引物，同时设计一对正向引物做对照，RT-PCR时设立 一组gDNA模板对照，证实circRNA来自转录后剪切，而不是基因融合等突变。同时检测线性 基因 GAPDH作为阴性对照。使用的引物如下所列（如SEQ ID N0:2至9所示）：
[0051 ] 4.PCR:以GAPDH作为内对照。PCR的反应体系：每个反应管中分别加入2μ1 10X Buffer，分别加入2μ1 dNTP，lyl正向引物，ΙμL反向引物，ΙμL cDNA模板，0.2μ1 Taq酶，加水 至20μ11CR反应条件如下:94°C，5分钟预变性;94°C，30秒变性;55°C，30秒退火;72°C，30秒 延伸;35个循环，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，结果见图2,图2中环状RNA引物为反向 引物（黑色三角形符号），同时设计一对正向引物做对照（白色三角形符号），RT-PCR时设立 一组gDNA模板对照，证实circRNA来自转录后剪切，而不是基因融合等突变。同时检测线性 基因 GAPDH作为阴性对照。PCR产物送测序公司测序，能明确检测到环化位点，结果见图3,将 图2中的RT-PCR产物送测序公司进行sanger测序，测序结果显示环化位点，证实circ-ZKSCAN1发生环化。.
[0052] 实施例2:QPCR检测肝癌中circ-ZKSCANl的表达情况 [0053] 1.RNA提取：同实施例1;
[0054] 2.CDNA逆转录：同实施例1;
[0055] 3.QPCR扩增实验
[0056] 1)实验体系：
[0058] 选用实施例1的circ-ZKSCANldivergent引物用于扩增环状RNA circ-ZKSCANl，实 施例1的hsaGAPDH convergent引物用于扩增内参基因。
[0059] 2)反应条件：
[0060]第一步：95°C2min
[0061 ]第二步(40个循环）：95°C3秒，60°C30秒
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