一种来源于马克斯克鲁维酵母的高表达启动子及其表达系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物基因工程应用领域，具体涉及包含一种来源于马克斯克鲁维酵 母的高表达启动子和外泌信号肽、包含该启动子和信号肽的重组载体、利用该载体在多种 酵母中实现目的基因的高表达方法。
【背景技术】
[0002] 酵母细胞用于外源蛋白的分泌表达一直以来就被人们广泛关注。酵母细胞以其适 于大规模生产、翻译后修饰系统较为完善以及无内毒素污染问题等优点而被研究人员广泛 应用。但同样酵母细胞也具有表达量不高、信号肽加工不完全导致不能分泌大蛋白等缺点。 目前，应用广泛同时也相对成熟的酵母表达系统包括酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母等。但是，传统的酵母表达体系在表达量和信号肽加工等方面 还有待进一步完善。
[0003] -些新型的非传统酵母，特别是马克斯克鲁维酵母，具有生长快、底物谱广泛、耐 受高温等优势，受到了越来越多的关注，是极具开发前景的新型酵母表达系统和生物基化 学品和生物能源的生产菌株(Appl Microbiol Biotechnol，2008,79:339_354;FEMS Yeast Research，2015，15，1-13)。但截止目前，较为理想的启动子和信号肽研究较少，同时能够在 其中自主复制并能够简单筛选的表达系统也相对匮乏，这些问题最终导致了马克斯克鲁维 酵母至今无法广泛应用于各种蛋白的异源表达和基因工程改造。
[0004] 外源蛋白在宿主细胞内的异源表达的前提在于携带目的基因的载体能够在宿主 细胞内进行自主的复制、转录和翻译过程，这一过程受制于不同宿主细胞内不同的复制起 点。但是，与酿酒酵母和毕赤酵母相比，克鲁维属酵母作为宿主细胞的表达载体相对受限。 真正使得克鲁维属酵母作为表达宿主而被人们关注是由于pKDl质粒的发现(Falcone et al. Plasmid，1986，15:248-252.)。含有pKDl质粒复制起点的表达载体能够保证其在酿酒酵 母、乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母等中进行复制，并最终实现外源蛋白的表达。
[0005] 外源蛋白的表达量或者表达效率在很大程度上取决于选取的启动子的转录活性 (PNAS，2005,102(36): 12678-12683)。目前应用于克鲁维属表达系统的启动子分为三类:其 自身启动子、来源于酿酒酵母启动子和非酵母启动子，如Tet-off，且多使用酿酒酵母的启 动子(Appl Microbiol Biotechnol，2013,97(5): 2029-41)。而蛋白的胞外表达借助于外泌 信号肽的介导，高效的信号肽同样能够帮助蛋白在胞外实现高表达量，并有利于进一步的 蛋白分离纯化工作。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种来源于马克斯克鲁维酵母的高表达启动子(KmlNUl启动子）、高效 外泌的信号肽及其相应的表达系统。
[0007] 本发明是采用如下技术方案来实现的：
[0008] 本发明的第一方面，提供一种高表达的启动子，其核苷酸序列为(a)~（d)中的任 意一种：
[0009] (a)如SEQ ID No. 1表示的核苷酸序列；
[0010] (b)如SEQ ID No.2表示的核苷酸序列；
[0011] (C)截断上述(a)的核苷酸序列获得的核苷酸序列，其中截断获得的核苷酸序列包 含上述(b)的核苷酸序列；
[0012] (d)与上述（a)~（c)的核苷酸序列具有80%同源性并且在马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus)和除马克斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有启 动子活性的核苷酸序列。
[0013] 上述高表达启动子命名为KmlNUl启动子。
[0014]本发明的第二方面，提供一种用于引导如上述所述的高表达启动子(KmlNUl启动 子)调控的外源蛋白分泌的信号肽，其特征在于，其核苷酸序列为(e)和(f)中的任意一种： [0015] (e)如SEQ ID No.3表示的核苷酸序列；
[0016] (f)与上述(e)的核苷酸序列具有80%同源性并且在马克斯克鲁维酵母和除马克 斯克鲁维酵母以外的至少一种以上的酵母中具有外泌蛋白能力的核苷酸序列。
[0017] 本发明的第三方面，提供一种载体，其包含上述所述的高表达启动子(KmlNUl启动 子)所述的高表达启动子、上述所述的信号肽和能够在该高表达启动子的调控下工作的方 式配置的外源蛋白基因。
[0018] 进一步地，所述载体含有在酵母中扩增的复制起点序列、筛选标记URA3基因和卡 那霉素抗性基因，其中所述的复制起点序列如SEQ ID No.4。
[0019] 本发明上述所述的载体，带有在克鲁维酵母中扩增的复制起点，能够在克鲁维属 酵母中实现目的基因的胞外高表达;且该载体带有URA3基因和卡那霉素抗性基因，具有简 单筛选特性。
[0020] 本发明的第四方面，提供一种转化体，其通过将上述所述的载体导入酵母中而得 到。
[0021 ] 进一步地，所述的酵母为马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)乳酸克 鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的任意一 种。
[0022] 本发明的第五方面，提供一种外源蛋白基因的高表达方法，包括对上述所述的转 化体进行培养的步骤。
[0023] 进一步地，上述所述的外源蛋白基因的高表达方法，还包括对培养得到的转化体 中回收外源蛋白基因表达产物的步骤。
[0024] 与现有的克鲁维属的表达载体相比，本发明具有如下优点：
[0025] (1)本发明所述的KmlNUl启动子具有较强的转录启动活性，不需要诱导物即可启 动其下游基因的转录。并且该启动子在很大程度上解除了酵母中普遍存在的碳源阻遏效 应，在相对较高的碳源浓度条件下能够保持较高的转录活性；
[0026] (2)本发明所述的外源蛋白表达载体含有高效的菊粉酶信号肽，能够实现外源蛋 白的胞外表达，为后续的分离纯化奠定基础；
[0027] (3)本发明所述的外源蛋白表达载体含有卡那霉素的抗性基因，能够在酵母菌宿 主内实现快速方便筛选；
[0028] (4)本发明所述的表达载体的蛋白表达量随着时间逐渐积累，特别适合表达影响 细胞生长的蛋白。
【附图说明】
[0029] 图1是本发明提供的含有卡那抗性基因的载体PCXJ10-kan的结构示意图。
[0030] 图2是本发明提供的含有367bp KmlNUl启动子和信号肽的胞外蛋白表达载体 pCXJ10-kan-PS的结构示意图。
[0031 ]图3是本发明提供的含有菊粉酶的表达载体pCXJ10-kan-inu的结构示意图。
[0032]图4是不同截断长度的KmlNUl启动子的启动活性比较。
[0033]图5是367bp KmlNUl启动子进一步截断的启动活性比较。
[0034] 图6是KmlNUl启动子(如SEQ ID No. 1所示）的结构与功能示意图。
[0035]图7是以乳酸克鲁维酵母为宿主，绿色荧光蛋白为报告基因的KmlNUl启动子和 KmPGK启动子的活性比较。
[0036]图8是在乳酸克鲁维酵母中，KmlNUl启动子启动菊粉酶基因表达性能评价。
[0037]图9是在马克斯克鲁维酵母中，KmlNUl启动子启动菊粉酶基因表达性能评价。
【具体实施方式】
[0038] 下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以 任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所 用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
[0039] 本发明使用的材料：质粒 pCXJ10(Gene, 1996,172:131-136)，NCBI GeneBank U34314;质粒pYES2.0为Biovector公司的Biovector 104802;质粒pFA6a_kanMX4 (Nucleotide sequence of the kanamycin resistance transposon Tn903, J.Mol .Biol · 1981，147(2) ,217-226)，GeneBank:AJ002680 · 1;质粒pZQ03(张秋美·酿酒酵母 乙醇响应报告载体的构建和研究.大连理工大学硕士论文，2009)，带有eGFP基因 (GeneBank: JQ064510.1);聚合酶链式反应(PCR)扩增试剂盒为Takara公司的产品PCR试剂 盒。
[0040] 本发明所用引物名称以及其序列如表1，划线部分为酶切位点。
[0041 ]表1.引物名称以及其序列
[0042]
[0043]
[0044] 实施例1
[0045] (l)KmlNUl启动子的获取
[0046] 将鹰嘴豆胞克鲁维酵母(Kluyveromyces (3；[061^8口01'118)0334857的基因组为模 板，Inu-1058(SEQIDNo.ll)和Inu-0(SEQ