一种检测急性单核细胞白血病的适配体、筛选方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及急性单核细胞白血病检测技术的研究领域，更具体地说，是可用于分 子水平上检测急性单核细胞白血病的核酸适配体及其筛选方法和应用。
【背景技术】
[0002] 白血病是一类造血干细胞的克隆性疾病，是一组高度异质性的恶性血液病，其特 点为骨髓和其他造血组织中的白血病细胞异常增生且分化成熟障碍，而使正常造血功能受 抑制，中青年以下人群尤其是儿童的发病率较高。目前临床白血病诊断方法以传统的FAB分 型和MICM分型为主。但形态学诊断方法，易受主观因素的影响；免疫学、细胞遗传学、分子生 物学分型诊断，存在周期长、操作复杂、费时费力或仪器设备成本高等缺点。如果能利用分 子生物学的原理，寻找到白血病细胞表面的特异性分子标志物，以此研发相应的诊断试剂 和靶向治疗药物将在日后的应用中发挥巨大的作用。
[0003] 指数富集的配基系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands Exponential Enrichment，SELEX)，是一种能获取与祀分子高选择、高亲和力结合的寡核 苷酸的筛选技术，制备出的产物被称为适配体(aptamers)。适配体安全、无毒，具备特殊的 三维结构，确保了其可与靶分子高特异性的结合，并可进一步改变靶分子的生物活性和生 命进程。适配体最大优势是没有免疫原性，并且分子量小、可化学合成、稳定性强、易于修饰 和标记，与传统化学方法和免疫学方法相比具有无可比拟的优越性。近年来在传统SELEX技 术基础上，各类衍生SELEX技术如消减SELEX技术、自动化SELEX技术等也被不断发展和完 善，被广泛应用在生命科学研究、生物医药等领域，特别是在疾病的诊断与治疗等方面，显 示出广阔的应用前景。目前已有几种适配体诊断技术和适配体药物进入到了临床试验或临 床应用阶段。
[0004] Cel ι-SELEX以完整细胞为靶标的消减SELEX技术。它是一种改良SELEX技术，其特 点是在经典的筛选过程中扣除与共有靶标结合的寡核苷酸序列，消减后的次级文库继续投 入到筛选中。凭借消减SELEX技术可实现从两组高度同源的靶分子中，筛选到其中任意一种 靶分子的特异性寡核苷酸文库。
[0005] 细胞膜是由非常复杂的分子组成，特别在细胞膜表面存在着不同功能的蛋白质。 这些不同种类的蛋白质有着不同空间构像与结构域。蛋白质分子的结构域可以与其相应的 寡核苷酸链结合形成寡核苷酸链一蛋白质复合物。这种复合物的形成如同抗原与抗体的结 合一样具有高特异性与高亲和性。基于这种分子结合的特异性，以四种脱氧核苷酸为原料， 通过指数富集方式合成自由组合的寡核苷酸链（<l〇〇mer)作为探针，应用白血病细胞表面 的蛋白质作为靶细胞靶点进行特异性筛选，筛选最终获得的与目标白血病细胞高特异性结 合的DNA探针（又称作核酸适配体）用于白血病细胞与正常细胞的鉴别、白血病的分类诊断 等。目前国内外尚无文献报导针对急性单核细胞白血病诊断的特异生物探针。
[0006] 本发明以人急性单核细胞白血病U-937细胞为靶细胞，应用Cel ι-SELEX技术通过 正向及削减筛选过程制备了高特异性和高亲和性的U-937细胞适配体(ssDNA)，也称诊断生 物探针。该生物探针的特点如下对急性单核细胞白血病细胞的细胞膜蛋白质靶点具有 高度选择性与高度亲和性;急性单核细胞白血病-ssDNA文库的构建，为未来的临床应用 提供了省时、简便、成本低、效率高的保证;'f在生物探针合成的过程中可以依据试验的需 要进行生物化学的改造，例如连接生物素、羧基、氨基或者巯基。这些修饰并不影响生物探 针对蛋白质靶点的辨认。基于该生物探针这一独到的特点，该探针可以连接药物分子、核酸 酶阻抗碱基的修饰(保护核酸不被水解）。这样有利于体内的试验跟踪以及直接将连接的药 物分子送达到白血病细胞表面，起到特异诊断与靶向治疗的双重效果。
【发明内容】
[0007]我们应用正向筛选同时穿插反向消减技术完成了高特异性和高亲和性的急性单 核细胞白血病细胞适配体(AML-M5-SSDNA)的构建。因此本发明提供特异结合急性单核细胞 白血病细胞的核酸适配体探针;提供核酸适配体检测急性单核细胞白血病的应用方法，为 急性单核细胞白血病的靶向治疗奠定方法学基础。具体步骤如下： (1) 合成随机单链DNA文库和引物 随机单链DNA文库：5'-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-40nt-TGG ACA CGG TGG CTT AGT-3， 上游荧光素标记的引物:5'-FITC-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-3' 下游生物素标记的引物:5'-BIO-ACT AAG CCA CCG TGT CCA-3' 上游引物:5'-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-3' 下游引物:5'-ACT AAG CCA CCG TGT CCA-3' (2) Cell-SELEX 筛选流程 应用含有20%新生牛血清的1640培养液培养人急性单核细胞白血病U-937细胞(该细 胞株由吉林省人民医院医学诊治实验中心赠送），当细胞数量达5xl06/ml后继续培养12h， 离心获得沉淀，将随机单链DNA文库配制成工作液加入沉淀中（终浓度ΙΟΟΟηΜ)摇匀，37°C振 荡60min，洗涤去除尚未与目标细胞结合的ssDNA，恒温金属浴95°C加热lOmin，12000r/min 离心5min，获取上清，即为急性单核细胞白血病U-937细胞的特异性核酸适配体； (3) 文库扩增 利用步骤（1)中的上、下游引物对在步骤(2 )中获得的急性单核细胞白血病U-937细胞 的特异性核酸适配体进行PCR扩增，得到的产物为双链DNA(dsDNA);PCR扩增体系为1000μ1: 2XTaq PCR Mix 500μ1，模板400μ1，上游引物40μ1，下游引物40 μL，ddH20 20μ1，扩增程 序为：95°C150s，95°C30s，56 · 3°C30s，72 °C30s，经过 10轮循环，72°C180s; (4) DNA单链文库的制备 利用步骤(3)中获得的dsDNA上的标记与链霉亲和素化琼脂糖微珠上链霉素的亲和作 用，将dsDNA结合到磁珠表面，在磁珠中加入碱液反应后，回收得到上清液，然后加入无水乙 醇，离心后获得沉淀。将沉淀溶于水中测定浓度，分装出需要的重量并制成干粉，即为急性 单核细胞白血病U-937细胞的特异性核酸适配体，用作下一轮筛选的ssDNA文库； (5) 重复多轮筛选 将步骤(4)收集到的ssDNA代替步骤（1)中的随机文库，重复以上步骤(2)~(4)至少13 次，即得到用于检测急性单核细胞白血病的核酸适配体。每轮筛选后都要进行最佳PCR条件 的优化:选择最佳循环次数、模板浓度等优化的PCR条件进行大量制备dsDNA(图1，2); (6) 消减筛选 以上述方式完成13轮次的正向筛选过程中，穿插2次急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞 进行消减筛选，以此达到去除与急性单核细胞白血病细胞结合的非特异性寡核苷酸的目 的。消减纯化的ssDNA再进行PCR扩增转变成dsDNA、纯化、亲和层析再制备成ssDNA文库； (7) 筛选后亲和力测定 为保证筛选出的核酸适配体识别急性单核细胞白血病细胞的能力最强，需进行亲和力 测定。将后几轮的筛选产物，用标记有FITC的上游引物和标记有生物素的下游引物进行PCR 扩增。PCR所得的dsDNA用链霉亲和素化琼脂糖微珠和碱的体系使其解链，收集含有FITC的 链在520nm进行荧光测定。当荧光强度的增加趋于饱和，表明经过筛选后，ssDNA文库与U-937细胞的亲和力达到了最大，U-937细胞的特异性ssDNA文库即构建成功(图3); (8) 核酸适配体的特异性检测 分别取急性单核细胞白血病U-937细胞、急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞、急性早幼粒 细胞白血病HL-60细胞，计数细胞数达2xl06/ml，离心获得细胞沉淀。将筛选获得的急性单 核细胞白血病的核酸适配体配制成工作液加入细胞沉淀中（终浓度ΙΟΟΟηΜ)摇匀、振荡 30min、洗涤去除尚未与目标细胞结合的ssDNA、收集细胞加热95°C10min后冷却、离心，收集 上清，进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳。电泳结果的判断标准是:在50-100bp之间（76bp)出现 条带说明核酸适配体能够与细胞结合，不出现条带的即不能结合。结果发现:筛选获得的核 酸适配体能与急性单核细胞白血病U-937细胞特异性结合，电泳后有明显的条带，而与急性 淋巴细胞白血病Jurkat细胞、急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞几乎没有结合(图4)。
【附图说明】
[0008]图1是最佳PCR条件优化的电泳图： M:50 bp标准DNA; 1-4:模板浓度均为10%，扩增循环次数依次为6，8，10和12; 5-8模板浓度均为15%，扩增循环次数依次为6，8，10和12; 9-12模板浓度均为20%，扩增循环次数依次为6，8，10和12; 图2是大量制备的dsDNA纯化后电泳图： M:100 bp标准DNA;1:大量制备的dsDNA 图3是不同筛选次数520nm荧光光谱： 1:第6轮荧光光谱;2:第7轮荧光光谱;3:第9荧光光谱;4:第10轮荧光光谱； 5:第11轮荧光光谱;6:第12轮荧光光谱。7:第13轮荧光光谱； 图4是核酸适配体的特异性检测电泳图 M:50bp 标准 DNA; 1:空白对照 2:急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞与适配体的结合； 3:急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞与适配体的结合； 4:急性单核细胞白血病U-937细胞与适配体的结合； 图5是急性单核细胞白血病核酸适配体的临床应用电泳图 M:100bp 标准 DNA; 1:急性淋巴细胞白血病患者骨髓细胞与适配体的结合； 2~3:标准的急性单核细胞白血病细胞U-937与适配体的结合； 4:急性早幼粒细胞白血病患者骨髓细胞与适配体的结合； 5~9:临床诊断明确的急性单核细胞白血病患者骨髓细胞与适配体的结合。 【具体实施方式】 [0009] 实施例一： 1. 合成随机单链DNA文库和引物 随机单链DNA文库:5'-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-40nt-TGG ACA CGG TGG CTTAGT-3' 上游荧光素标记的引物:5'-FITC-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-3' 下游生物素标记的引物：5'-BI0-ACT AAG CCA CCG TGT CCA-3' 上游引物:5'-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-3' 下游引物:5'-ACT AAG CCA CCG TGT CCA-3' 2. Cell-SELEX筛选流程 Cel 1-SELEX筛选获得特异性识别急性单核细胞白血病的核酸适配体 2.1取ΙΟμΜ的上述随机ssDNA文库ΙμL溶解在350μ1 binding buffer中，95°C恒温水浴 5min，然后立即置于冰盒上备用； 2.2 1640培养液中加入20%新生牛血清培养急性单核细胞白血病U-937细胞，当细胞 数达到5X106/ml时进行实验。800r/min离心3min，弃去上清留下细胞沉淀，用3m