CGGGCTCAGGACGCTGGCTGCAGCCCTAAGTTAGACCGCTACCCATGGAAGTGCATGGACCATCACATCCTGTGTGGACCAGCAGAGAACAAATGCCAAGAACTTTTGTGCAGGTGTGACGAGGAGCTGGCTTACTGCCTGGCAGGGACCGAGTACCACCTGAAATACCTCTTCTTCCCCTCCATTTTATGTGAGAAG375 GACTCTCCCAAGTGCAATTGA蛋白序列
I GGLLELAGTLDCVGPRSPMAYMNYGCYCGLGGHGEPRDAIDWCCYHHDCCYSRAQDAGCSPKLDRYPffKCMDHHILCGPAENKCQELLCRCDEELAYCLAGTEYHLKYLFFPSILCEK125 DSPKCN.提取小鼠全基因组，PCR法获得PLA2基因序列。
[0021 ] 上游引物3:
ACCGGT GGAGGA CTCCTG GAGCT下游引物4:
CTCGAG TCAATT GCACTT GGGAGA GTCPCR反应条件:
1、95°C3 min
2、94°CI min； 58°C 30 s； 72°C I min； 30 cycles
3、72°C10 min
4、4°Cstore
3、SUM01-PLA2融合蛋白基因全长的构建
首先用引物I和引物2配对，以鸡的全基因组为模板PCR扩增得到SUMOl基因，然后再以引物3和引物4配对，以鼠细胞全基因组为模板PCR扩增得到PLA2，将PCR得到的两个产物分别双酶切，PCo IdTF双酶切，琼脂糖凝胶回收双酶切产物，最终经T4DNA连接酶的作用下将融合基因连接到冷诱导原核表达载体PColdTF上，其中NdeI和XhoI两酶切位点之间一段基因序列即为融合蛋白基因SUM01-PLA2。
[0022]具体过程如下:
(I)NdeI和XhoI双酶切原核表达载体质粒pColdTF，回收大片段。
[0023](2)NdeI和AgeI双酶切SUM01，回收酶切产物。
[0024](3)AgeI和XhoI双酶切PLA2，回收酶切产物。
[0025](4)将上述三个回收产物连接得到pColdTF-SUM01_PLA2重组质粒，转入T0P10感受态细菌中，挑单菌落，提取质粒，测序结果，与预期一致。构建入原核表达载体后，阅读框为:
I ATGTCGGACCAGGAAGCAAAGCCTTCAGCTGAGGACTTAGGAGATAAGAAAGAGGGGGAATACATTAAACTCAAAGTCATTGGGCAGGACAGCAGTGAAATTCACTTCAAGGTGAAAATGACAACACACCTCAAGAAACTCAAAGAATCATACTGTCAAAGACAGGGTGTTCCAATGAACTCACTCAGGTTTCTCTTCGAGGGTCAGAGAATTACTGATAATCATACCCCCAAGGAGCTGGGGATGGAGGAGGAAGATGTGATTGAAGTTTATCAGGAACAGACCGGTGGAGGACTCCTGGAGCTGGCAGGGACCTTGGATTGTGTTGGGCCTCGATCTCCGATGGCTTACATGAACTATGGCTGTTATTGTGGCCTTGGTGGCCATGGAGAGCCACGTGACGCCATTGACTGGTGCTGCTACCACCACGACTGCTGCTACTCTCGGGCTCAGGACGCTGGCTGCAGCCCTAAGTTAGACCGCTACCCATGGAAGTGCATGGACCATCACATCCTGTGTGGACCAGCAGAGAACAAATGCCAAGAACTTTTGTGCAGGTGTGACGAGGAGCTGGCTTACTGCCTGGCAGGGACCGAGTACCACCTGAAATACCTCTTCTTCCCCTCCATTTTATGTGAGAAGGACTCTCC
663 CAAGTGCAATTGA
表达序列为:
I MSDQEAKPSAEDLGDKKEGEYIKLKVIGQDSSEIHFKVKMTTHLKKLKESYCQRQGVPMNSLRFLFEGQRITDNHTPKELGMEEEDVIEVYQEQTGGGLLELAGTLDCVGPRSPMAYMNYGCYCGLGGHGEPRDAIDWCCYHHDCCYSRAQDAGCSPKLDRYPWKCMDHHILCGPAENKCQELLCRCDEELAYCL
221 AGTEYHLKYLFFPSILCEKDSPKCN。
[0026]4、融合蛋白TF-SUM01-PLA2的制备
(1)pColdTF-SUM01-PLA229质粒转入 B121(DE3)感受态细菌中；
(2)挑单菌落至5ml LB培养基中，37°C震荡培养过夜，1/1000接菌至400 ml LB培养基中，37°C震荡培养至OD6qq至0.8-1.0，加入终浓度为0.1 mM IPTG，继续15°C震荡培养12小时；
(3)TF-SUM01-PLA229—151融合蛋白纯化
1)4°C4000g离心收集菌体，PBS(pH 7.4)洗涤一次，按照每克湿菌加入50 ml BufferA(500 mM NaCl, 50 mM Tris, 10 mM imidazol, 10% glycerol; (pH 7.4))重悬菌体；
2)超声裂解细菌(工作时间3秒，间歇时间5秒，强度450W，总工作时长10分钟)。12，000Xg，4°C离心30分钟，留取上清；
3)收集上清，0.45μπι滤膜过滤，备用；
4)Ni层析介质空跑，10倍体积的ddH20洗涤后，再用5倍体积的BufferA平衡；
5)将步骤3所制备的样品，与步骤4的Ni介质(0.5mlNi介质/g湿菌)混合，4°C翻转摇床上，轻摇2小时；
6)将步骤5的样品连同Ni介质一同装柱。200ml Buffer A充分洗涤；
7)洗脱；10ml洗脱液(500 mM NaCl, 50 mM Tris, 100 mM imidazol, 10% glycerol;(pH 7.4))(用Buffer A与Buffer D适当比例混合而成)洗脱，流速控制在8_10滴/分钟。收集OD28q峰值处流出液，约6-8 ml ；
8)透析与储存；
透析:一个小时之内，至少四次更换透析液(500 mM NaCl , 50 mM Tris, 10%glycerol; (pH 7.4))，用以除去残存的咪卩坐和尿素； 透析后的样品，12，OOO X g，4°C离心5分钟，分装上清，迅速置于液氮中过夜。_80°C冰箱保存，备用；
4、融合蛋白TF-SUM01-PLA2作为去SUMO化酶底物的用途
(1)SENPl对融合蛋白TF-SUMO1-PLA2的切割
在20 yL体系中50 nM SENPl可以将500 nM TF-SUM01-PLA2完全切开，形成TF-SUMOl和PLA2，酶切结果如图4所示；
(2)上述得到的PLA2可以特异性水解底物NBDC6-HPC形成荧光产物NBD，通过检测荧光的强度得到酶及融合蛋白的活性及酶切效率，结果如5所示。
【主权项】
1.一种融合蛋白SUM01-PLA2，其特征在于:其的氨基酸序列如SEQ n0.1所示。2.权利要求1所述的融合蛋白SUMO1-PLA2的制备方法，包括以下步骤: I)鸡SUMOl基因的获取 提取鸡全基因组;PCR法扩增SUMOl基因序列;所用引物为: 上游引物: CATATG ATGTCG GACCAG GAAGCA AAG 下游引物: ACCGGT CTGTT CCTGAT AAACTTC 以鸡全基因组为模板，上述两条引物，PCR方法得到鸡SUMOI基因； 2 )鼠源性PLA2-基因的获取 提取小鼠基因组;PCR法扩增PLA2基因序列;所用引物为: 上游引物: ACCGGT GGAGGA CTCCTG GAGCT 下游引物: CTCGAG TCAATT GCACTT GGGAGA GTC 以小鼠全基因组为模板，上述两条引物，PCR方法得到PLA2基因序列； 3)SUM01-PLA2融合蛋白基因全长的构建 SUM03基因PCR扩增后产物经双酶切(NdeI和AgeI)和PLA2基因PCR扩增产物经双酶切(AgeI和XhoI)后，凝胶回收双酶切产物;pColdTF表达质粒双酶切(NdeI和XhoI)后，凝胶回收大片段;将上述三个回收片段连接，获得将融合蛋白全长基因构建入PColdTF表达载体中的重组质粒，既融合蛋白原核表达质粒pColdTF-SUM03-PLA2;其中NdeI和XhoI两酶切位点之间一段基因序列即为融合蛋白基因SUM03-PLA2; 4 )融合蛋白TF-SUMO1-PLA2的制备 将融合蛋白原核表达质粒TF-SUM01-PLA2导入到BL2UDE3)原核表达菌体系，37°C终浓度0.1 mM IPTG诱导表达载体蛋白；非变性条件下，Ni亲和层析一步法纯化融合蛋白。3.权利要求1中的融合蛋白作为去SUMO酶底物的用途，可以作为一种底物用来作人、哺乳动物及鸟类去SUM03化酶类的活性分析检测试剂盒。
【专利摘要】本发明提供一种融合蛋白SUMO1-PLA2及制备方法，本发明还提供了该SUMO1化融合蛋白的医用用途，解决了PLA2在大肠杆菌不溶性表达的技术难题；利用pColdTF冷诱导表达载体高效制备融合蛋白SUMO1-PLA2，克服现有方法中PLA2？蛋白表达量低、表达产物以包涵体形式存在给后续纯化带来诸多不便，以及表达产物的反应原性和免疫原性不如可溶性蛋白好等缺陷。
【IPC分类】C12Q1/37, C12N15/70, C07K19/00, C12N9/18
【公开号】CN105542012
【申请号】CN201510333868
【发明人】艾永兴, 于佩峰, 邓晨, 吴山力, 郑海南, 王梦云, 赵程程, 郝林琳, 于浩, 张玉静
【申请人】吉林大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年6月17日