胞之间发生分离，此时用移液器吸走消化液，弃掉，细胞仍然贴在细胞瓶壁上，用全功能培养基重悬，按照1: 2的比例进行传代，具体的，将一瓶的细胞消化后的细胞悬液，分成2份，I份在原瓶，另一份放入新的培养瓶内，然后2瓶分别补加全功能培养基，分别定容到5mL。获得传代脑组织细胞系。
[0043]4.细胞冻存
[0044]选取传代培养的鲫鱼脑组织细胞系中，处于指数生长期，且细胞密度达到90%以上的传代培养脑细胞。一般，培养3天可达到指数生长期，细胞密度通过显微镜观察其生长密度来判断，覆盖细胞培养瓶瓶底的90 %即细胞密度达到90 %。
[0045]然后再加入0.25%胰蛋白酶和0.02 % EDTA的混合消化液，消化30s左右，待到贴壁细胞变圆，细胞之间发生分离，此时用移液器吸走消化液，弃掉。用含有1%二甲基亚砜的胎牛血清，重悬细胞，将细胞悬液加入无菌冻存管中大约每管lmL，放入程序降温盒，并置于-80°C超低温冰箱，过夜，于次日将细胞转移到液氮罐长期保存。
[0046]以上即获得本例的鲫鱼脑组织细胞系，将“4.细胞冻存”保存于液氮罐中的无菌冻存管取出，用干冰冷链寄送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC N0.C2015159。
[0047]5.细胞复苏
[0048]自液氮中取出保存的冻存管，迅速置于37°C水浴中融化，1500r/min离心5min，弃上清，并加入ImL上述1.1中配制的全功能培养基重悬细胞，接种到25cm2培养瓶中，放置于培养箱中28 ± 0.2°C培养，备用。
[0049 ] 二、鲫鱼脑组织细胞系的生态学检测
[0050] 1.细胞形态观察
[0051 ]取细胞复苏后，指数生长期的鲫鱼脑组织细胞，在倒置相差显微镜下观察细胞形态。结果如图1所示，观察显示，细胞呈单层贴壁细胞，形态似上皮样铺路石状的星形胶质细胞，细胞之间存在接触抑制。
[0052]2.细胞生长情况
[0053]采用MTT法测定细胞的生长曲线，取生长状况良好的80代细胞，弃去培养基，用2mL缓冲液D-Hank ’ s液(PH= 7.0)，清洗细胞，清洗完后，加入0.25 %胰蛋白酶和0.02 %EDTA的混合消化液，消化30s左右，待到贴壁细胞变圆，细胞之间发生分离，此时用移液器吸走消化液，弃掉。加入全功能培养基，制成单细胞悬浮液，采用活细胞计数板计数，以I X 14个/mL均匀接种细胞于96孔细胞培养板，每孔加细胞悬液200yL，分别培养在15、20、25、28°C的培养箱中，每个温度组设5个复孔，共接种4块培养板。分别在连续孵育24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、148小时和172小时后，测试细胞的生长情况。测试方法为，向孔中加入20yL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，继续孵育4h后终止培养;快速翻转培养板，弃去上清液，每孔加入150yL的二甲基亚砜(缩写DMS0)，振荡lOmin，使MTT蓝紫色结晶完全溶解。用酶联免疫检测仪于490nm处检测各孔的吸光值，S卩OD值，并以未接种细胞只加培养基孔的吸光值为空白对照调零，取5孔平均值。实验重复3次，以培养“时间”为横轴，“吸光值”为纵轴绘制细胞生长曲线。
[0054]测试结果如图2所示，可见，本例的鲫鱼脑组织细胞系在28°C培养条件下生长状态最好，细胞在贴壁生长后，第I天生长较慢，第2天生长开始加快，进入对数生长期，持续3天左右进入平台期。
[0055]3.细胞类型鉴定
[0056]取80代鲫鱼脑组织细胞系，以IX 105/cm2密度接种于预先放置盖玻片的6孔培养板中，其中放置有全功能培养基，培养24h后，弃掉全功能培养基，用PBS冲洗3次，然后加入4%的多聚甲醛固定15min，再用PBS冲洗，滴加2.5yL—抗，4°C孵育24h，PBS洗涤3次，再滴加2.5yL 二抗，25°C避光作用30min，PBS洗涤3次，然后采用荧光显微镜观察。本例采用的荧光显微镜为Zeiss AX1 OBSERVER Al倒置荧光显微镜。本例中，一抗由Rabbit ant1-GFAP[ERP1034Y]ab68428溶于200yL的浓度为 1%的BSA制成，其中Rabbit anti_GFAP[ERP1034Y]ab68428购自abeam公司，BSA购自GIBCO公司。二抗为羊抗兔FITC-1gGjij自Sigma公司。
[0057]观察结果如图3所示，结果显示，有绿色荧光的表达，表明本例的鲫鱼脑组织细胞系为星形胶质细胞。
[0058]4.细胞周期分析
[0059]采用第80代的鲫鱼脑组织细胞系进行细胞周期研究，将细胞转至6孔板中，其中含有全功能培养基，培养约36h左右，此时细胞处于指数生长期，形成70 %?80 %的汇合层。弃去培养基，用2mL缓冲液D-Hank ’ s液(PH= 7.0)，清洗细胞，清洗完后，加入0.25 %胰蛋白酶和0.02%EDTA的混合消化液，消化30s左右，待到贴壁细胞变圆，细胞之间发生分离，此时用移液器吸走消化液，弃掉。加入全功能培养基，制成单细胞悬浮液;室温下1000r/min离心5min，收集沉淀，用PBS洗2次，1000r/min离心5min，收集沉淀。先用20?50μ1/ηι1的杜氏磷酸盐缓冲液(缩写D-PBS)将细胞沉淀充分打散成单个细胞，用4°C预冷的70 %冰乙醇ImL重悬，4°C过夜，采用Cytomics FC 500Beckman Coulter型号的流式细胞仪进行细胞周期检测。
[0060]检测结果如图4所示，可见，本例的鲫鱼脑组织细胞系核型正常，为二倍体。测试结果显示，鲫鱼脑组织细胞系在Gl期的DNA含量占51.36%，在S期的DNA含量占32.62%，G2期为12.38%，G2/G1为1.91，表明鲫鱼脑组织细胞系增殖活力旺盛，且为正常的二倍体细胞。
[0061]三、外源基因在鲫鱼脑组织细胞系中的表达
[0062]采用L0NZA4D电转仪转染方法，取80代鲫鱼脑细胞星形胶质细胞系，以IX 1 Vcm2密度接种于96孔板中，待细胞生长36h后，即贴壁稳定生长，采用3中的传代方法，在原细胞生长孔，将细胞消化制成细胞悬液，然后吸出放于L0NZA4D电转仪专用电转板条内，每个孔对应相应的电转板条孔，根据SE Cell Line 4D-Nucleofector X Kit)说明书，配置电转液，试剂盒中soulut1n 16.4yL与supplement 3.6yL混合，制成电转混合液，即每孔用量，将此混合液加入电转板条中一个孔的细胞悬液中，每孔加入0.1yg GFP质粒，采用EN-150电转程序进行转染，转染完成后，将细胞悬液放入96孔板中，置于28°C培养箱培养2?3天，然后在荧光显微镜下观察转染情况。
[0063]结果如图5所示，可见，有30%的细胞表达较强的绿色荧光，说明外源基因可以在鲫鱼脑组织细胞系中稳定高效表达。
[0064]以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
【主权项】
1.一种鲫鱼脑组织细胞系，其特征在于:所述鲫鱼脑组织细胞系为鲫鱼脑组织中分离的鲫鱼脑组织细胞，所述鲫鱼脑组织细胞系的保藏号为CCTCC N0.C2015159。2.根据权利要求1所述的鲫鱼脑组织细胞系，其特征在于:所述鲫鱼脑组织细胞为上皮样的星形胶质细胞。3.根据权利要求1或2所述的鲫鱼脑组织细胞系，其特征在于:所述鲫鱼脑组织细胞系能稳定连续传代至少80代。4.根据权利要求1-3任一项所述的鲫鱼脑组织细胞系在鲫鱼病毒的培养和/或检测中的应用。5.根据权利要求1-3任一项所述的鲫鱼脑组织细胞系作为研究水产动物病毒的宿主细胞的应用。6.根据权利要求1-3任一项所述的鲫鱼脑组织细胞系在水产动物病毒的分离中的应用。
【专利摘要】本申请公开了一种鲫鱼脑组织细胞系及其应用。本申请的鲫鱼脑组织细胞系，为鲫鱼脑组织中分离的鲫鱼脑组织细胞，鲫鱼脑组织细胞系的保藏号为CCTCC？No.C2015159。本申请的鲫鱼脑组织细胞系，填补了鲫鱼脑组织细胞系研究的空白，为感染鲫鱼的病毒提供了一种新的研究工具，特别是为以鲫鱼脑组织为靶器官的病毒的深入研究奠定了基础。CCTCC No.C201515920150923
【IPC分类】C12R1/91, C12N5/071, C12Q1/70, C12N7/00
【公开号】CN105543162
【申请号】CN201510852727
【发明人】王津津, 贾鹏, 刘莹, 于力, 何俊强, 郑晓聪, 阮周曦, 秦智峰, 史秀杰, 兰文升, 刘荭
【申请人】深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年11月27日