以纯化的wbaD基因的上下同源臂为模板，用引物DwbaD-lF/ DwbaD-2R扩增融合片段。PCR反应体系为：于50yL反应体系中：上下游同源臂DNA各lyL， 25mmol/L MgCl20.5yL，buffer 10yL，10ymol/L 上、下游引物各lyL，2mmol/LdNTPs，DNA polymerase 0.2yL，ddH20 33.75yL。具体条件为：98°C变性5min后进入循环，循环参数为94 °C 30s，55°C 30s，72°C lmin，共循环30次。循环后72°C延伸lOmin。扩增的产物经1%的琼 脂糖凝胶电泳分析后，由DNA纯化回收试剂盒纯化PCR产物。
[0050] 自杀质粒pRE112-AwbaD的构建：用Ahdl酶切质粒PRE112载体，回收纯化酶切产 物，用连接试剂盒连接PRE112大片段与同源臂融合片段。连接产物转化c7232感受态细胞， 涂于含氯霉素抗性（25yg/mL)的LB固体平板，37 °C培养16h，PCR鉴定阳性菌落。挑取阳性菌 落到LB液体培养基，37°C、200r/min培养过夜，小量抽提质粒。
[0051 ] 将构建成功的重组自杀质粒pRE112_AwbaD转化入C7213感受态细胞。以含有重组 自杀质粒的C7213菌株为供体菌，C3545株为受体菌进行接合转移。接合转移步骤如下：用含 DAP的液体LB培养供体菌，用LB培养受体菌，至0D6QQ为0.6左右，取供体菌500ul，受体菌 300ul于含氯霉素抗性(25yg/mL)平板混匀，正放培养24h，挑取菌苔，划线，37 °C静止培养， 直至得到单菌落。得到的单菌落进行蔗糖负筛，具体步骤如下：挑取单菌落加入无 Nacl LB 液体培养基，37°C，70rpm，摇菌2h，取100ul菌液10倍倍比稀释1000倍后，再取100ul菌液涂 含10%蔗糖的LB平板。挑取单菌落分别划线于LB平板和含氯霉素抗性(25yg/mL)平板，选取 LB平板生长，含氯霉素抗性(25yg/mL)平板不生长菌落，用DwbaD-lF/DwbaD-2R进行进一步 鉴定，鉴定阳性的菌落命名为S.Cholerasuis S1210。
[0052] 实验例1基因缺失株的表型特征鉴定
[0053] 我们将对实施例1所得菌株和野生株的脂多糖进行对比观察，它们是猪霍乱沙门 菌重要的免疫原或毒力因子。
[0054] 脂多糖的提取和银染观察:提取小量LPS用于银染观察，具体步骤为:取过夜培养 的实施例1所得菌株和野生株菌液各2-31^，1，2000\8离心111^11，收集菌体;用?83或超纯水 洗菌体2到3次；取 150yL裂解Buffer(lmL 0.5M Tris-cl PH=6.8,0.8mL甘油，1.6mL 10% SDS，0.4mLf3-巯基乙醇，4.2mL超纯水），混匀菌体后用沸水煮10min;样品冷却至室温，于1， 2000Xg，4°C离心 10min;取上清液 10yL加入到90yL上样Buffer中（lmL 0.5M Tris-cl PH= 6.8，0.8mL甘油，0.005g溴酚蓝，6.2mL超纯水），加入lyL蛋白酶K，37 °C消化lh。进行SDS-PAGE电泳，银染观察。
[0055]结果见说明书附图1。
[0056]实验例2猪霍乱沙门囷wbaD基因缺失株减毒效果测定
[0057]为测定构建的基因缺失株C3545 AwbaD的减毒效果，采用了 口服方式比较基因缺 失株和亲本株对小鼠的毒力变化情况。本实验购买六周龄BALB/c雌鼠，饲养一周适应环境 后进行口服途径攻毒，每组3只，共八组，其中六组为突变株，一组为口服BSG的空白组，一组 为口服野生株C3545的阳性对照组。突变株口服剂量为1 X 108CFU和1 X 109CFU，阳性对照组 口服剂量为1X105CFU和1X106CFU。攻毒后小鼠饲养4周，每日观察其生长状况，并记录。按 照Reed and Muench法计算鸭子半数致死量(50%lethal dose,LD50)，评价基因缺失株较 亲本株毒力减弱程度。
[0058] 参照实施例1的思路，我们构建了缺失wzy基因、wbaB基因、wbaC基因、manB基因、 manC基因的猪霍乱沙门氏菌，作为对照。
[0059] 实验结果见表1和表2。
[0060] 表1 口服后小鼠死亡情况
[0061]
[0062]表中，"wzy"代表给小鼠口服缺失了wzy基因的猪霍乱沙门氏菌，其余组别含义类 同。
[0063]表2实验小鼠攻毒具体计量情况
[0064]
[0065]
【主权项】
1. 一株减毒猪霍乱沙门氏菌S. Cholerasuis S1210，其特征在于，所述减毒猪霍乱沙门 氏菌S.Cholerasuis S1210缺失wbaD基因，分类命名为S.Cholerasuis S1210,保藏于中国 典型培养物保藏中心，保藏号为:CCTCC Μ 2015632,保藏时间为:2015年10月22日。2. 制备如权利要求1所述减毒猪霍乱沙门氏菌S.Cholerasuis S1210的方法，其特征在 于，所述方法包括如下步骤： 对wbaD基因的上同源臂和下同源臂进行扩增； 用猪霍乱沙门菌C3545基因组为模板，扩增wbaD的上同源臂和下同源臂； 融合片段构建：以wbaD基因片段的上同源臂和下同源臂为模板，扩增同源臂融合片段； 用AhdI酶切质粒pRE 112，回收纯化酶切产物，用连接试剂盒连接pRE 112大片段与同源 臂融合片段，连接产物经转化和质粒抽提后，得到质粒pREl 12-Δ wbaD; 将质粒PRE112- Δ wbaD转入c7232菌株感受态细胞，以含有质粒pRE112- Δ wbaD的c7213 菌株为供体菌，以C3545菌株作为受体菌，进行结合转移，经PCR鉴定后，得到减毒猪霍乱沙 门氏菌S.Cholerasuis S1210; 所述wbaD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 所述wbaD基因片段的上同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示； 所述wbaD基因片段的下同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述方法中，用于扩增wbaD基因的上同 源臂的引物为： DwbaD-lF ：GACCATAGAGTCCAAAGTGA DwbaD-1R ：AAACGCGCTGTTACTTTTTTCCATATAAAA 用于扩增wbaD基因的下同源臂的引物为： DwbaD-2F ：AAAAAAGTAACAGCGCGTTTATCAGTTTTG DwbaD-2R:CATTTTAAAGCTGCCAAGGCT。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中，对wbaD基因的上同源臂进行扩 增时，扩增片段大小为416 bp;对wbaD基因的下同源臂进行扩增时，扩增片段大小为511 bp〇5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤2 )中进行扩增时，PCR反应体系为： 于50 yL反应体系中进行，具体反应体系为模板DNA 1 yL，Takara高保真酶25 yL，上、下游 引物各1 yL，ddH20 22 yL;具体条件为:98°C变性2 min后进入循环，循环参数为98 °C 10 s，55 °C 15 s，72°C 30 s，共循环30次;循环后72 °C延伸 10min。6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤3)中进行融合片段构建时，PCR反应 体系为：于50yL反应体系中：上下游同源臂DNA各1 yL，Takara高保真酶25 yL，10 μ mol/L 上、下游引物各1 yL，ddH20 22 yL;具体条件为:98 °C变性5 min后进入循环，循环参数为 98 °C 10 s，55 °C 15 s，72 °C 30 s，共循环30次;循环后72 °C 延伸 10min。7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤5)所述结合转移步骤为：用含DAP的液 体LB培养基培养供体菌，用LB培养基培养受体菌，至OD600为0.6左右，取供体菌500 ul，受体 菌300 ul于含氯霉素抗性(25 yg/mL)平板一侧混匀，平板斜放，正放培养24 h，挑取菌苔， 划线，37°C静止培养，直至得到单菌落，得到的单菌落进行蔗糖负筛。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蔗糖负筛的步骤为:挑取单菌落加入 无 NaCl的LB液体培养基，于37 °C，70 rpm下，摇菌2 h，取100 ul菌液10倍倍比稀释1000倍 后，再取100u 1菌液涂含10%蔗糖的LB平板。9. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤5 )所述PCR鉴定，步骤为： 对长出单菌落的蔗糖平板，选择一个区域进行挑菌，每个菌落同时分别划线于Cm板LB 板，挑菌时沾到即可不要挑到菌落下方菌； 鉴定并存菌，在于挑取10~20个Cm不生长，LB生长的菌落，得到的阳性菌落再次划线LB 板后，PCR鉴定，仍为阳性者，为缺失株构建成功； PCR反应体系:up水4.4ul、模板DNA 0.2ul、上同源臂上游引物0.2ul、下同源臂下游引 物 0.2ul、Pfu PCR Master(KP201)5ul;PCR反应条件：94°C预变性5min、94°C变性30s、55°C 退火3〇8、72°0延伸1111；[11、72°(^延伸1〇111；[11、变性至延伸步骤重复30个循环。10. 权利要求1所述减毒猪霍乱沙门氏菌S.Cholerasuis S1210在疫苗上的应用。
【专利摘要】本发明提供了一株减毒猪霍乱沙门氏菌<i>S</i>.Cholerasuis？S1210，其特征在于，所述减毒猪霍乱沙门氏菌<i>S</i>.Cholerasuis？S1210缺失wbaD基因，分类命名为<i>S</i>.Cholerasuis？S1210，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC？M？2015632，保藏时间为：2015年10月22日。本发明还提供了制备减毒猪霍乱沙门氏菌<i>S</i>.Cholerasuis？S1210的方法及其在疫苗上的应用。CCTCC NO: M 201563220151022
【IPC分类】C12N15/74, A61K39/112, C12R1/42, C12N1/21, A61P31/04
【公开号】CN105624079
【申请号】CN201510725832
【发明人】孔庆科, 刘田, 刘青, 赵新新
【申请人】四川农业大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2015年11月2日