上样，过柱，要注意液体过柱的流速，控制在lml/min;
[0057](6)5个柱体积的Binding buffer洗脱杂蛋白；
[°°58] (7)5?10个柱体积的Elut1n buffer洗脱目的蛋白，并回收至新的EP管里。
[0059]纯化后的ahcy蛋白经SDS-PAGE验证分析后的结果如图2所示，纯化后的目的蛋白大小为55KD，与预期大小相同。
[0000]实施例2六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)的制备
[0061 ]步骤一、4°C下，将六糖与高碘酸钠按照摩尔比为1:1的比例混合，在pH 6.0的PBS中反应Ih;
[0062]步骤二、室温下，按照EDC与NHS的摩尔比为1:1的比例，向步骤一所得反应体系中加入EDC(可溶于水的碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)反应6h;
[0063]步骤三、室温下，按照ahcy蛋白与六糖的摩尔比为1:1000的比例，向步骤二所得反应体系中加入ahcy蛋白过夜反应；
[0064]步骤四、4°C下，在50mmol/L、pH8.0?9.6的碳酸盐溶液中透析511;
[0065]步骤五、4°C下，在50mmol/L、pH7.0?8.0的PBS中透析一天，获得六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)。
[0066]六糖与ahcy蛋白发生反应的比例通过以下方法确认:利用BCA试剂盒测量反应产物中ahcy蛋白的含量以及确定反应蛋白的物质的量，同时利用苯酚硫酸法测量反应产物中六糖的含量以及确定反应糖的物质的量，从而确定六糖与ahcy蛋白发生反应的摩尔比为:六糖:ahcy蛋白= 1000:1(摩尔比)，反应后糖蛋白(六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe))中六糖与ahcy蛋白的摩尔比为:六糖:ahcy蛋白=2.4:1(摩尔比)。
[0067]实施例3六种寡糖修饰蛋白的制备
[0068]按照实施例2的步骤，制备六种寡糖修饰蛋白，即单糖修饰ahcy蛋白(ahcym)，二糖修饰ahcy蛋白(ahcymbi)，三糖修饰ahcy蛋白(ahcymtr)，四糖修饰ahcy蛋白(ahcymte)，五糖修饰ahcy蛋白(ahcympe)，六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)。
[0069]实施例4小鼠脾淋巴细胞增殖试验(MTT法)
[0070]1、将制备的ahcy蛋白和六种寡糖修饰蛋白分别免疫雌性小鼠，50ug/只，免疫后2周强化免疫I次，免疫后4周，取脾，制备脾淋巴细胞，检测脾淋巴细胞增殖。
[0071]2、当脾淋巴细胞浓度为2 X 16个/ml时，加入96孔培养板中，2 X 15个细胞/ΙΟΟμΙ/孔，每组设3孔。
[0072]3、加入终浓度分别为5yg/ml、lyg/ml、0.lyg/ml的ConA(刀豆蛋白A)，ΙΟΟμΙ/孔，作为阳性对照组。加入终浓度分别为5yg/ml、lyg/ml、0.lyg/ml的ahcy蛋白以及六种寡糖修饰蛋白，刺激相应蛋白免疫小鼠后取得的脾淋巴细胞，作为实验组。阴性对照为RPM1-1640培养基，空白对照为不含脾淋巴细胞和寡糖修饰蛋白的RPM1-1640培养基。
[0073]37°C，5%C02培养箱培养12h，加入20μ1 MTT试剂，继续培养4h，于490nm波长测OD值，从而计算得到刺激增殖指数IS。
[0074]刺激增殖指数IS=(OD-ODi64o)/(0Dpbs_0Di64q)，ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞的IS(刺激增殖指数)分别为1.63和4.52,六糖修饰蛋白(ahcymhe)的IS是ahcy蛋白的2.77倍。
[0075]小鼠脾淋巴细胞增殖试验结果如图3所示，ahcy蛋白及六种寡糖修饰蛋白均对小鼠脾淋巴细胞有增殖作用，经过比较可知，二糖修饰ahcy蛋白(ahcymbi)和六糖修饰ahcy蛋白(a h c y m h e)对小鼠脾淋巴细胞增殖作用较为明显。六种寡糖修饰蛋白表示为单糖修饰ahcy蛋白(ahcym)，二糖修饰ahcy蛋白(ahcymbi)，三糖修饰ahcy蛋白(ahcymtr)，四糖修饰ahcy蛋白(ahcymte)，五糖修饰ahcy蛋白(ahcympe)，六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)。
[0076]实施例5小鼠抗体效价检测
[0077]将制备的ahcy蛋白、二糖修饰ahcy蛋白(ahcymbi)、四糖修饰ahcy蛋白(ahcymte)、五糖修饰ahcy蛋白(ahcympe)和六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)分别免疫雌性小鼠，50ug/只，免疫后2周强化免疫I次，每周取血，检测抗体效价。
[0078]小鼠抗体效价增长曲线如图4所示，ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)的抗体效价IgG分别为1:64000和1:128000，六糖修饰蛋白(ahcymhe)抗体效价IgG较ahcy蛋白在4?5周时提高I倍，在免疫后第五周抗体水平达到峰值，并且只有一次峰值出现，证明六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)刺激机体引起了比其他蛋白较强的体液免疫。
[0079]实施例6细胞因子检测
[0080]参照实施例4制备和培养小鼠脾淋巴细胞，然后分别用ahcy蛋白、二糖修饰ahcy蛋白(ahcymbi)、四糖修饰ahcy蛋白(ahcymte)、五糖修饰ahcy蛋白(ahcympe)和六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞，12小时后检测培养液上清中细胞因子INF-γ、IL-2、IL-10的含量，所用的ahcy蛋白、二糖修饰ahcy蛋白(ahcymbi )、四糖修饰ahcy蛋白(ahcymte)、五糖修饰ahcy蛋白(ahcympe)和六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)的浓度均5yg/ml。[0081 ]细胞因子的含量检测结果如图5、图6和图7所示，ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe )刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IFN-γ的量分别为902.27pg/ml和6192.045pg/ml，六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IFN- γ的量是ahcy蛋白的6.86倍;ahcy蛋白、六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IL-2的量分别为43.23pg/ml和166.76pg/ml，六糖修饰蛋白(ahcymhe)刺激小鼠脾淋巴细胞后产生细胞因子IL-2的量是ahcy蛋白的4.87倍。
[0082]通过上述分析可知，六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)免疫小鼠后脾淋巴细胞体外刺激产生细胞因子INF-丫、IL-2、IL_10的量相对ahcy蛋白要高很多，这说明六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)在细胞免疫上优于未修饰蛋白即ahcy蛋白。
[0083]综合以上三方面免疫评价方法，说明六糖修饰ahcy蛋白(ahcymhe)细胞免疫和体液免疫均有提高，可为布鲁氏菌提供更好的疫苗候选抗原。
[0084]以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步的详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和发明构思，做出相应改变和替代，而且得到与本发明具有相同步骤的提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法，其性能也必然相同，都应当视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一、4°C下，将六糖与高碘酸钠按摩尔比为1:1的比例混合，在pH 6.0的PBS中反应lh； 步骤二、室温下，按EDC与NHS的摩尔比为1:1的比例，向步骤一所得反应体系中加入EDC和NHS，反应6h; 步骤三、室温下，按ahcy蛋白与六糖的摩尔比为1:1000的比例，向步骤二所得反应体系中加入ahcy蛋白，过夜反应； 步骤四、4°C下，在50mmol/L、pH8.0?9.6的碳酸盐溶液中透析511; 步骤五、4°(:下，在50臟01/1^!17.0?8.0的？85中透析一天。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ahcy蛋白通过以下方法制备: 步骤一、将大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)制备成感受态细胞后，转化重组质粒pET28a_ahcy 构建 pET-28a_ahcy/BL21 表达菌株，pET-28a_ahcy/BL21 表达菌株用终浓度lmmol/L的IPTG诱导6h表达蛋白； 步骤二、离心收集E.coli BL21细胞，用PBS洗涤2次，5000rmp/min，离心15min，收集菌液； 步骤三、加入冰预冷的50mmol/L、pH8.0的Tris-HCl和2mmol/L的EDTA，洗涤菌液一次，所加入的Tr i s-HCl和EDTA的总体积为菌液体积的I /5; 步骤四、离心收集菌液，重悬于冰预冷的10mmol/L、pH8.0的Tris-HCl中，Tris-HCl的体积为菌液体积的1/10，加入溶菌酶至0.lmg/ml，再加入I %的Tri ton X-100，37 °C孵育15min； 步骤五、加入终浓度为lmmol/L的PMSF，置冰浴中超声裂解菌体，超声lOsec，间歇1sec，最大功率300W、超声30min，超声破碎直至溶液不再粘稠且呈现透明状态； 步骤六、12000rpm，4 °C离心30min，取离心上清液用0.45μηι滤膜过滤，对过滤后的上清液进行SDS-PAGE验证分析，结果目的蛋白大小为55KD，与预期大小相同。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括步骤七、HisTrap FF亲合层析柱纯化目的蛋白: (1)5个柱体积的馏水洗涤柱； (2)5个柱体积的Elut1nbuffer洗涤柱； (3)5个柱体积的馏水洗涤柱； (4)10个柱体积的Binding buffer平衡柱； (5)上样，过柱，要注意液体过柱的流速，控制在lml/min; (6)5个柱体积的Bindingbuffer冼脱杂蛋白； (7)5?10个柱体积的Elut1nbuffer洗脱目的蛋白，并回收至新的EP管里，对纯化后的ahcy蛋白进行SDS-PAGE验证分析，结果纯化后的目的蛋白大小为55KD，与预期大小相同。4.权利要求1至3任意一项所述的提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法获得的六糖修饰ahcy蛋白。
【专利摘要】提高S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶免疫原性的方法及六糖修饰ahcy蛋白，涉及蛋白免疫原性领域，其目的是为了给布鲁氏菌提供更好的疫苗候选抗原。该方法为：4℃将六糖与高碘酸钠按摩尔比1:1混合在pH？6.0的PBS中反应1h；室温将EDC与NHS按摩尔比1:1加入上述体系中反应6h；室温将ahcy蛋白按ahcy蛋白与六糖摩尔比1:1000加入上述体系中过夜反应；4℃在50mmol/L、pH8.0～9.6的碳酸盐溶液中透析5h，再在50mmol/L、pH7.0～8.0的PBS中透析一天。获得的六糖修饰ahcy蛋白的刺激增殖指数、抗体效价、刺激小鼠脾淋巴细胞后产生的IFN-γ和IL-2的量都大大提高。
【IPC分类】C12N9/14, A61K39/10, A61P31/04
【公开号】CN105671016
【申请号】CN201610115975
【发明人】王秀然, 许春晓, 卢天成, 王晓龙, 王浩, 王岩, 李海燕, 李校堃, 孙喆, 李晓薇, 孙天旭, 王法微, 杨晶, 王艳芳, 刘秀明, 付玉芹
【申请人】吉林农业大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月2日