一种非综合征耳聋基因检测膜条以及pcr引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种可用于医学上诊断人遗传性非综合征耳聋的杂交膜条，具体设及 一种非综合征耳聋基因检测膜条W及用于扩增待检样品基因片段的PCR引物。
【背景技术】
[0002] 耳聋是一种最常见的人类感觉系统缺陷，因其病因复杂、发生率高和治疗困难等 原因而长久地困扰着广大患者及其周围人群，极大地影响着相互交流和生活质量。重度耳 聋在新生儿中发生率高达1/800~1/1000,全世界将近有屯千万人罹患55分贝W上的听力减 退。
[0003] 耳聋病因是多方面的，60%W上的新生聋儿是由遗传因素导致的。耳聋可W由单一 基因突变或不同基因的复合突变引起。也可由环境因素、或基因与环境两者共同作用而致。 遗传性耳聋具有广泛的遗传异质性，根据是否伴有耳外组织的异常或病变可将其分为综合 征型和非综合征型，伴随有其他组织器官的病变的耳聋属于综合征型听力缺损(symlromic hearing impairment, SHI )，不伴有其他症状的耳聋属于非综合征型听力缺损 (nonyn化omic hearing impai;rment，NSHI) ,NSHI占70% W上。至2011年1 月 1 日止，与非综 合征耳聋相关的25个常染色体隐性基因、36个常染色体显性基因、2个X连锁基因已被克隆， 而每个基因中又散在数目众多的耳聋突变位点，因而具有较高的基因和位点遗传异质性。 最近，在国内开展的大规模耳聋分子流行病学研究表明，相当一部分非综合征性耳聋仅由 为数不多的几个基因突变引起，如GJB2、SLC26A4，mtDNA 12s rRNA及GJB3等，运为我们大规 模开展耳聋基因筛查及诊断提供了理论依据。
[0004] 目前，传统基因诊断方法包括酶切，限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymo巧hism，RFLP)，直接测序等，运些方法或者不能定性，或者耗时费 力、所需设备和耗材昂贵，更重要的是运些方法难W同时对不同基因的多个突变位点进行 检测。而基因忍片法虽然能同时对不同基因位点进行检测，但它所需设备和耗材昂贵，不适 用于在临床大规模推广，应用受到限制。因此有必要建立一种高通量、高效率、价格低廉、使 用方便的基因突变检测方法，W实现临床快速检测和大规模人群筛查。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种非综合征耳聋基因检测膜 条，该基因检测膜条可W检测20个基因突变位点共20种突变类型，应用基因检测膜条进行 检测，能直接对待检者的基因型进行确诊，具有准确性高、特异性强，能检出基因隐性携带 者等优点。
[0006] 本发明还提供了一种非综合征耳聋基因检测膜条的制备方法。
[0007] 本发明的另一目的在于针对现有技术中的不足，提供一种用于扩增待检样品基因 片段的PCR引物，该PCR引物能满足20个基因突变位点在同一个反应体系和反应条件下扩 增，引物特异性好，准确率高，与探针的结合性能好，扩增速率快，对于临床检测具有很强的 临床指导意义。
[000引本发明还提供了一种采用上述所述的PCR引物扩增待检样品基因片段的方法。
[0009] 本发明的目的通过W下技术方案实现:一种非综合征耳聋的基因检测膜条，包括 基底W及在所述基底上固定有正常对照探针和特异性的突变检测探针，共包括用于检测20 个基因突变位点的20条突变检测探针和10条正常对照探针，所述20个基因突变位点分别为 35delG、167delT、176-191dell6、235delC、299-300delAT、538C〉T、547G〉A、1555A〉G、1494C> T、281C〉T、589G〉A、IVS7-2A〉G、1174A〉T、1226G〉A、1229C〉T、IVS15+5G〉A、1975GX：、2027T〉A、 21620T 和 2168A〉G。
[0010] 本发明的基因检测膜条可W检测20个基因突变位点共20种突变类型，应用基因检 测膜条进行检测，能直接对待检者的基因型进行确诊，具有准确性高、特异性强，能检出基 因隐性携带者等优点。
[0011] 优选的，所述20条突变检测探针分别为：176M、235M、299M、538M、35M 1497M、 1555M、IVS7-2M、2168M、167M、281M、1174M、1229M、1975M、2162M、547M、589M、1226M、IVS15+ 5M和2027M，所述20条突变检测探针的3 '端或5 '端均带有氨基标记。
[0012] 更为优选的，所述突巧枪测探针的具体序列分别为：
[0013] 优选的，所述10条正常对照探针分别为：35N、176N、235N、299N、538N、1497N、 1555NJVS7-2N和2168N和1226/1229N，所述10条正常对照探针的3'端或5'端均带有氨基 标记。
[0014] 更为优选的，所述正常对照探针的具体序列分别为：
[0015] 优选的，所述检测膜条上的探针阵列具体从左至右包括3行10列依次排列，共30个 探针位点，第一行的探针排列为：35N、176N、235N、299N、538N、1494N、1555N、IVS7-2N、1226/ 1229N 和 2168N;第二行的探针排列为：35M、176M、235M、299M、538M、1494M、1555M、IVS7-2M、 1226M和2168M;第S行的探针排列为：167M、281M、589M、IVS15+5M、547M、1975M、2027M、 1174M、1229M和2162M。
[0016] -种非综合征耳聋的基因检测膜条的制备方法，包括如下步骤： a. 用打印机在基底上打印位点阵列，并标明相应位点的探针名称； b. 用EDAC溶液泡膜30min，W活化尼龙膜表面的簇基； C.分别用探针稀释液将30条探针稀释至扣mol/l; d.按尼龙膜条上打印的位点阵列，将30条探针按探针名称对应分别点加在尼龙膜相应 位点上，探针上的氨基与尼龙膜表面的簇基发生交联反应； e .待尼龙膜条干燥后，用0.1mol/L的化OH泡膜5分钟，W封闭尼龙膜表面未反应的簇 基； f.纯水洗涂膜条，干燥后即可。
[0017] 本发明的制备方法通过固定探针的膜条表面带有簇基集团，能与探针中的氨基发 生反应，将探针用探针稀释液稀释后，点加于膜条表面相应的位置上，构成检测阵列。
[0018] 本发明的另一目的通过W下技术方案实现：一种用于扩增待检样品基因片段的 PCR引物，包括分别用于扩增上述所述的20个基因突变位点的10对共20条引物，分别简写为 HL1F、HL1R、HL2F、HL2R、HL3F、HL3R、HL4F、HL4R、HL5F、HL5R、HL6F、HL6R、HL7F、HL7R、HL8F、 化83、化9。、化91?、化1(^、化101?，其中，化1。和化11?的扩增位点为35(1616、167(1611'、176-191dell6、235delC、299-300delAT，HL2F 和HL2R 的扩增位点为 538C〉T、547G〉A，HL3F 和HL3R 的扩增位点为15554〉6、149401'，化4。和化41?的扩增位点为28101'，化5。和化51?的扩增位点 为 589G〉A，HL6F 和 HL6R 的扩增位点为 IVS7-2A〉G，HL7F 和 HL7R 的扩增位点为 1174A〉T、1226G〉 八、122901'，化8。和化81?的扩增位点为1￥515+56〉4，化9。和化91?的扩增位点为19756〉(：、 2027T〉A，HL10F 和 HLlOR 的扩增位点为 2162C〉T、2168A〉G。。
[0019] 本发明的PCR引物能满足20个基因突变位点在同一个反应体系和反应条件下扩 增，引物特异性好，准确率高，与探针的结合性能好，扩增速率快，对于临床检测具有很强的 临床指导意义。
[0020] 优选的，所述20条引物的5'端均带有生物素标记或巧光素标记，所述20条引物的 序列分别为：
[0021] -种采用上述所述的PCR引物扩增待检样品基因片段的方法，包括如下步骤： 步骤1:合成10对引物，配制成25化的PCR反应液，PCR反应液含有各成份及浓度分别为： 10对引物浓度分别为0.2皿ol/L、Taq酶为0.1U/化、lXPCRBuffer、MgC12为1.5mmol/L、 dNTP为0.2mmol/L、模板DNA ^lOng/yL。