枝顶孢霉菌及其应用
【专利摘要】本发明涉及枝顶孢霉菌及其应用，该菌株命名为Acremonium sp.Y0997，菌株保藏号为CCTCC NO:M 2016117，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2016年3月14日，可用于实现现场修复石油污染土壤或落地油泥以及酚酸类物质积累的经济作物连作土壤的生物改良，可显著地提高重度石油污染土壤或油泥的降解效率，大大缩短修复周期，改良经济作物连作土壤的连作障碍，降低病虫害，提高作物产量。CCTCC NO: M 201611720160314
【专利说明】
枝顶孢霉菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种枝顶孢霉菌及其在重度石油污染土壤 或油泥的生物强化处理方面以及经济作物连作土壤改良方面的应用。 技术背景
[0002] 石油污染土壤的生物强化(Bioaugmentation)是通过利用生物技术、工程学、环境 学和生态学手段来筛选优势降解菌种，对菌种进行改造，提高底物和微生物接触机会以促 进污染物高效降解。生物强化修复能否成功，首先取决于能否筛选和获得具有降解能力的 外源微生物，高效降解菌首先要能克服石油烃的毒性，另外能利用石油烃成为其生长和代 谢的底物。影响生物强化修复策略成功与否的主要因素有生物强化菌株对环境的耐受能 力、对污染物的代谢潜力及污染物的生物可利用性等，环境因子如温度、湿度、PH、透气性和 营养物质含量等都是影响生物强化有效性的重要元素。
[0003] 经济作物连作土壤的连作障碍主要源于酚类物质的积累以及土壤区系微生物菌 群的恶化，而采取外接微生物的生物强化措施可以降解此类酚酸类物质，改善经济作物根 际区系菌群结构，从而缓解经济作物连作土壤的连作障碍，降低病虫害发生率，提高产量。
[0004] 基于"生态选择"以及微生物生态学的考虑，通过分析污染土壤中微生物群落，筛 选污染物的高效降解菌种，为环境修复领域微生物的"理性筛选"提供了有效途径。微生物 的筛选过程中将微生物的生态相互作用作为重要的筛选原则，将污染体系中时间和空间稳 定存在的且具有污染物降解能力的微生物分离出来，将有助于生物强化修复技术的成功实 施。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是筛选出一种能够降解重度石油污染土壤或油泥中的难降解组分， 实现重度石油污染土壤或油泥生物强化修复并对连作土壤有较好的生物改良效果，而且在 接种后存活率较高的枝顶孢霉菌。
[0006] 本发明的目的之二在于提供一种枝顶孢霉菌在重度石油污染土壤或油泥的生物 强化处理中的应用。
[0007] 本发明的目的之三在于提供一种枝顶孢霉菌在连作土壤生物改良方面的应用。
[0008] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0009] 枝顶孢霉菌Acremonium sp.Y0997,菌株保藏号为CCTCC N0:M 2016117,保藏单位 是中国典型培养物保藏中心，地址:武汉武汉大学。保藏日期是2016年3月14日，其ISSrDNA 序列为：
[0011] 该枝顶孢霉菌的菌落呈白色，菌落圆形，背面奶油色至赭黄色，菌丝无色，光滑且 具隔膜，孢子囊梗直接从菌丝上长出，呈锥形多单生，分生孢子无色，光滑，形成簇状或链 状，长纺锤形，两头尖，未见厚垣孢子。
[0012] 该枝顶孢霉菌的菌株分离方法为：
[0013] (1)含油污泥中微生物的富集
[0014] 称取10g含油污泥土样于石油富集液体培养基中，在160rpm/min、28°C条件下培养 7d，按10 %的接种量，用移液管吸取上清液转接于新鲜的石油富集液体培养基中，在 160rpm/min、28°C条件下培养7d。重复上述操作两次，备用。
[0015]石油富集液体培养基(g/L):K2HP〇4 2.0g/L，KH2P04 〇.2g/L，NaCl 0.04g/L，（NH4) 2SO4 5.0g/L，NaN03 5.0g/L，MgS〇4 〇.4g/L，CaCl2 〇.2g/L，微量元素浓缩液5mL，石油2g/L， 去尚子水1L，pH值7.0。
[0016]其中微量元素浓缩液：FeS〇4 4g/L，MnS〇4 4g/L，ZnS〇4 4g/L，CuS〇4 4g/L，H3B03 4g/L〇
[0017] (2)含油污泥中真菌的分离纯化
[0018] 将上述石油富集液体培养基按1:10进行梯度稀释，依次得到HT^HT2、1(T3、10 一4、 1(T5……的稀释的菌悬液，用移液枪吸取1〇〇此各个稀释度的样品加至制备好的TOA固体培 养基平板上，进行涂布，将涂布完成的平板置于恒温培养箱中，28 °C培养5~7天。
[0019] 用接种环挑选上述涂布平板中长势较好的真菌菌落于新鲜的TOA固体培养基平板 上进行划线分离，重复操作，反复地分离培养、驯化，直至得到纯化的菌株。根据纯化菌株的 菌落形态、生长速度、显微形态将相同的菌株合并。
[0020] (3)纯化真菌菌株的复筛
[0021] 用接种环挑取所分离纯化出的真菌划线于石油无机盐固体培养基上，于28°C的恒 温培养箱中培养，每种真菌三个重复。挑选在石油无机盐固体培养基上生长良好的真菌保 存。
[0022]石油无机盐固体培养基：K2HPO4 lg/L，KH2P04 lg/L，MgS〇4 ? H2O 0.5g/L，NH4N03 1.0g/L，CaCl2 0.02g/L，石油2g/L，琼脂2g/L，pH 7.0~7.2，去离子水比，115°(：高温灭菌15 ~20min〇
[0023] (4)真菌的形态学鉴定
[0024] 用插片法培养真菌，并在不同的时间段取样制片，在显微镜下观察并记录真菌菌 丝及孢子的形态。
[0025] Y0997菌落呈白色，菌落圆形，背面奶油色至赭黄色，菌丝无色，光滑且具隔膜，孢 子囊梗直接从菌丝上长出，呈锥形多单生，分生孢子无色，光滑，形成簇状或链状，长纺锤 形，两头尖，未见厚垣孢子 [0026] (5)真菌的分子生物学鉴定
[0027] 进行真菌基因组提取，并进行ITS序列扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析 后，切取目的片段凝胶进行产物纯化回收，将回收的扩增产物送生工生物工程(上海)股份 有限公司测序，并对测序结果进行同源性比较与遗传进化分析，对所获得的真菌进行种属 鉴定。
[0028] 经分子生物学鉴定:Y0997属于枝顶孢霉菌(Acremonium sp.)菌株保藏号为CCTCC NO:M 2016117,保藏于中国典型培养物保藏中心。地址:武汉武汉大学。
[0029]上述的枝顶孢霉菌在重度石油污染土壤或油泥的生物修复处理中的应用，其中一 种使用方法由以下步骤实现：
[0030] (1)采集重度石油污染土壤或油泥置于处理池中，将其敲碎，混匀；
[0031 ] (2)将培养好的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌接入重度石油污染土壤或油泥中，芽孢杆 菌的接种量为15~25g/kg 土壤或油泥，枝顶孢霉菌的接种量为15~25g/kg 土壤或油泥，混 匀，再加入有机肥料和表面活性剂，加水至土壤或油泥的含水率达15~30%，混匀，将处理 池的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在15~35°C下，现场处理 20~40天；
[0032] (3)将黄孢原毛平革菌序列接入经步骤（2)处理的土壤或油泥中，接种量为35~ 50g/kg土壤，混匀，用塑料薄膜将处理池的表面覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定， 在15~35 °C下，现场处理20~30天，完成处理。
[0033] 上述重度石油污染土壤或油泥的总石油烃起始含量为50000~120000mg/kg 土壤 或油泥。
[0034] 上述黄孢原毛平革菌的名称为Phanerochaete sp.F0996,菌株保藏号为CCTCC N0:M 2016116,保藏日期为2016年3月14日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心;地址:武 汉武汉大学。
[0035]所述芽孢杆菌的活菌含量为4.0 X 108~6.0 X 109CFU/g，枝顶孢霉菌的活菌含量是 7 ? 2 X 107~8 ? 5 X 109CFU/g，黄孢原毛平革菌的活菌含量是5 ? 6 X 107~8 ? 0 X 109CFU/g。
[0036]上述的枝顶孢霉菌在重度石油污染土壤或油泥的生物强化处理中的应用，其中另 一种使用方法由以下步骤实现：
[0037] (1)采集重度石油污染土壤或油泥置于处理池中，将其敲碎，混匀；
[0038] (2)将培养好的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌接入重度石油污染土壤或油泥中，芽孢杆 菌的接种量为15~25g/kg 土壤或油泥，枝顶孢霉菌的接种量为15~25g/kg 土壤或油泥，混 匀，再加入有机肥料和表面活性剂，其中有机肥料的添加量为800~1200mg/kg，表面活性剂 的添加量为1200~1600mg/kg，加水至土壤或油泥的含水率达15~30%，混匀，将处理池的 表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在15~35°C下处理20~40天；
[0039] (3)取与步骤(2)等量的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌，重复接入步骤(2)处理后的土壤 或油泥中，混匀，在用塑料薄膜将处理池的表面覆盖，通气，补水搅拌维持土壤或油泥的含 水率稳定，在15~35 °C下处理20~30天，完成处理。
[0040] 上述的枝顶孢霉菌在重度石油污染土壤或油泥的生物强化处理中的应用，其使用 方法还可以由以下步骤实现：
[0041 ] (1)采集重度石油污染土壤或油泥置于处理池中，将其敲碎，混匀；
[0042] (2)将培养好枝顶孢霉菌接入重度石油污染土壤或油泥中，枝顶孢霉菌的接种量 为75g/kg土壤，活菌含量为8.0 X 109CFU/g，加入有机肥料与表面活性剂，混匀，维持土壤或 油泥的含水率为15~30 %，将处理池的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水 率稳定，在15~35 °C下，现场处理60~70天，完成处理。
[0043]上述的枝顶孢霉菌在连作土壤的生物改良方面的应用，其中连作土壤中酚酸类物 质的起始含量为0.5~50mg/kg 土壤，具体的使用方法与在重度石油污染土壤或油泥的修复 方法相同。
[0044]采用本发明的枝顶孢霉菌可有效降解重度石油污染土壤或油泥中的TPH及PAHs成 分，提高土壤或油泥的修复能力，特别是与芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌组成真菌-细菌菌群 对重度石油污染土壤或油泥进行序列强化处理，可大大缩短了修复周期，对土壤或油泥中 难降解的多环芳香经：萘(Naphthalene，NAP)、荷(Fluorene，FL0)、菲(Phenanthrene，PHE)、 蒽(Anthracene，ANT)及焚蒽(Fluoranthene，FLA)的降解效果也比较显著，降解率均达到了 90 %以上，也可以用于生物改良连作土壤中，对连作土壤中的根皮苷、邻苯二甲酸、邻苯二 甲酸丁酯、焦性没食子酸等酚酸类物质有较好的降解效果，改良经济作物连作土壤的连作 障碍，降低病虫害，提高作物产量;此外该枝顶孢霉菌在现场对室外自然环境的耐受能力较 好，存活率较高。
【附图说明】
[0045] 图1为枝顶抱霉菌(Acremonium sp.Y0997)菌落图片；
[0046] 图2为枝顶孢霉菌(Acremonium sp.Y0997)处理污染土壤过程中生长情况。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明，但是本发明不仅限于下述的实施情 形。
[0048] 枝顶孢霉菌Acremonium sp.Y0997,菌株保藏号为CCTCC N0:M 2016117,保藏单位 是中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2016年3月14日。
[0049] 该枝顶孢霉菌的菌落呈白色，菌落圆形，背面奶油色至赭黄色，菌丝无色，光滑且 具隔膜，孢子囊梗直接从菌丝上长出，呈锥形多单生，分生孢子无色，光滑，形成簇状或链 状，长纺锤形，两头尖，未见厚垣孢子，参见图1。
[0050] 实施例1
[0051] 枝顶孢霉菌在重度石油污染土壤中应用时，具体的使用方法为：
[0052] (1)采集油井附近的重度石油污染土壤置于处理池中，将其敲碎，混匀；
[0053] (2)将培养好枝顶孢霉菌(Acremonium SP.Y0997)的固体菌剂接入总石油经起始 含为80000mg/kg的重度石油污染土壤中，枝顶抱霉囷的接种s；为75g/kg土壤，活囷含s；: 8.0 X 109CFU/g，菌剂的生长情况参见图2，加入适量有机肥料与表面活性剂，有机肥料与表 面活性剂的添加量分别为l〇〇〇mg/kg土壤，混匀，维持土壤的含水率为25%，将处理池的表 面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤的含水率稳定，在15~35°C下，现场处理60天，完成处 理，总石油烃TPH降解率达42.29%。
[0054] 实施例2
[0055]枝顶孢霉菌在重度石油污染土壤中应用时，具体的使用方法为：
[0056] (1)将油井附近采集的重度石油污染土壤置于处理池中，敲粹、混匀，粒径为30~ 40mm左右；
[0057] (2)将培养好的芽孢杆菌及枝顶孢霉菌菌剂混合接入污染土壤中，混匀，再加入有 机肥料和表面活性剂，加水调节土壤含水率，将处理池表面覆盖塑料薄膜，并适量通气，每 周补水维持土壤或油泥含水量稳定，在15~35°C下，现场处理20~40天。
[0058] (3)将黄孢原毛平革菌序列接入污染的土壤中，混匀，用塑料薄膜将处理池的表面 覆盖，通气，补水维持土壤含水量稳定，在15~35°C下，现场处理20~30天，完成重度石油污 染土壤或油泥的序列生物强化。
[0059] 芽抱杆菌Bacillus sp.，菌株保藏号CCTCC N0:AB 2014248,属于已知固体菌剂， 该菌菌落呈乳白色，菌落圆形，表面光滑、凸起，边缘整齐，背面颜色与正面一致，无色素分 布。
[0060] 黄抱原毛平革菌Phanerochaete sp.F0996,菌株保藏号为CCTCC N0:M2016116,保 藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2016年3月14日，该菌菌落白色，圆形，背面 无色，菌落仅有少量凸起;菌丝为无色，蓬松棉絮状，随着培养时间的延长，绒毛状凸起逐渐 变平，菌丝消失，形成粉末孢子，其株菌分离方法与枝顶孢霉菌的分离方法相同。该黄孢原 毛平革菌的DNA序列为：
[0062] 按照该方法进行实验，具体的工艺条件和降解效率参见表1。
[0063] 表1为各实验的工艺条件及降解效率
[0066] 实施例3
[0067] 枝顶孢霉菌在重度石油污染土壤中应用时，具体的使用方法为：
[0068] (1)采集重度石油污染土壤置于处理池中，将其敲碎，混匀；
[0069] (2)将培养好的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌接入重度石油污染土壤中，混匀，再加入有 机肥料和表面活性剂、磷酸二氢钾、尿素，加水至土壤或油泥的含水率达15~30%，混匀，将 处理池的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在15~35°C下处理20 ~40天；
[0070] (3)取与步骤(2)等量的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌，重复接入步骤(2)处理后的土壤 中，混匀，在用塑料薄膜将处理池的表面覆盖，通气，补水搅拌维持土壤的含水率稳定，在15 ~35 °C下处理20~30天，完成重度石油污染土壤的序列生物强化处理。
[0071]按照该方法进行实验，具体的工艺条件和降解效率参见表2所示。
[0072]表2为各实施例的工艺条件及降解效率
[0075]上述实施例中所用的表面活性剂是生物可兼容性表面活性重油清洗剂KD-L315， 属于市售产品。实施例中的磷酸二氢钾和尿素可以根据实际情况选择添加。
[0076] 对于总石油烃起始含量为50000~120000mg/kg的重度石油污染土壤或油泥均可 以用上述的方法进行修复，枝顶孢霉菌对其均有较好的降解效果。
[0077]从上述实施例1~3的降解率对比表明，本发明的枝顶孢霉菌在重度石油污染土壤 或油泥中对TPH的降解率明显提高，但是将其与芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌组合形成真菌-细菌菌群，再结合序列生物强化手段，对重度石油污染土壤或油泥的降解效率显著提高，特 别是对难降解的石油烃组分和多环芳香烃组分均有较好的降解效果。
[0078]上述各实施例中的处理对象重度石油污染土壤可以用重度石油污染油泥或连作 土壤来替换，连作土壤中酸酸类物质的起始含量为〇. 5~50mg/kg 土壤，其具体的修复或改 良方法与对重度石油污染土壤的修复方法相同，并且处理效果相近，特别是将枝顶孢霉菌 与芽孢杆菌、黄孢原毛平革菌组合形成真菌-细菌菌群，再结合序列生物强化手段，对连作 土壤进行生物改良时，对根皮苷、邻苯二甲酸、邻苯二甲酸丁酯、焦性没食子酸等酚酸类物 质的降解率可达80%以上。
【主权项】
1. 一种枝顶孢霉菌，其特征在于，命名为Acremonium sp. Y0997，菌株保藏号为CCTCC N0:M 2016117〇2. 根据权利要求1所述的枝顶孢霉菌，其特征在于枝顶孢霉菌的ISSrDNA序列为：3. 权利要求1所述的枝顶孢霉菌在重度石油污染土壤或油泥的生物修复处理中的应 用。4. 根据权利要求3所述的枝顶孢霉菌在重度石油污染土壤或油泥的生物强化处理中的 应用，其特征在于具体的使用方法由以下步骤组成： (1) 采集重度石油污染土壤或油泥置于处理池中，将其敲碎，混匀； (2) 将培养好的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌接入重度石油污染土壤或油泥中，芽孢杆菌的 接种量为15~25g/kg 土壤或油泥，枝顶孢霉菌的接种量为15~25g/kg 土壤或油泥，混勾，再 加入有机肥料和表面活性剂，加水至土壤或油泥的含水率达15~30%，混匀，将处理池的表 面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在15~35°C下，现场处理20~40 天； (3) 将黄孢原毛平革菌序列接入经步骤(2)处理的土壤或油泥中，接种量为35~50g/kg 土壤，混匀，用塑料薄膜将处理池的表面覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在15~ 35 °C下，现场处理20~30天，完成处理。5. 根据权利要求4所述的枝顶孢霉菌在重度石油污染土壤或油泥的生物强化处理中的 应用，其特征在于所述重度石油污染土壤或油泥的总石油烃起始含量为50000~120000mg/ kg 土壤或油泥。6. 根据权利要求4所述的枝顶孢霉菌在重度石油污染土壤或油泥的生物强化处理中的 应用，其特征在于所述黄孢原毛平革菌的名称为Phanerochaete sp.F0996，菌株保藏号为 CCTCC Ν0:Μ 2016116,保藏日期为2016年3月14日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心； 所述芽孢杆菌的活菌含量为4.0 X 108~6.0 X 109CFU/g，枝顶孢霉菌的活菌含量是7.2 X 107~8 · 5 X 109CFU/g，黄孢原毛平革菌的活菌含量是5 · 6 X 107~8 · 0 X 109CFU/g。7. 根据权利要求3所述的枝顶孢霉菌在重度石油污染土壤或油泥的生物强化处理中的 应用，其特征在于具体的使用方法由以下步骤组成： (1) 采集重度石油污染土壤或油泥置于处理池中，将其敲碎，混匀； (2) 将培养好的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌接入重度石油污染土壤或油泥中，芽孢杆菌的 接种量为15~25g/kg 土壤或油泥，枝顶孢霉菌的接种量为15~25g/kg 土壤或油泥，混勾，再 加入有机肥料和表面活性剂，其中有机肥料的添加量为800~1200mg/kg，表面活性剂的添 加量为1200~1600mg/kg，加水至土壤或油泥的含水率达15~30%，混匀，将处理池的表面 用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率稳定，在15~35°C下处理20~40天； (3)取与步骤(2)等量的芽孢杆菌和枝顶孢霉菌，重复接入步骤(2)处理后的土壤或油 泥中，混匀，在用塑料薄膜将处理池的表面覆盖，通气，补水搅拌维持土壤或油泥的含水率 稳定，在15~35 °C下处理20~30天，完成处理。8. 根据权利要求3所述的枝顶孢霉菌在重度石油污染土壤或油泥的生物强化处理中的 应用，其特征在于具体的使用方法由以下步骤组成： (1) 采集重度石油污染土壤或油泥置于处理池中，将其敲碎，混匀； (2) 将培养好枝顶孢霉菌接入重度石油污染土壤或油泥中，枝顶孢霉菌的接种量为 75g/kg 土壤，活菌含量为8.0 X 109CFU/g，加入有机肥料与表面活性剂，混匀，维持土壤或油 泥的含水率为15~30%，将处理池的表面用塑料薄膜覆盖，通气，维持土壤或油泥的含水率 稳定，在15~35 °C下，现场处理60~70天，完成处理。9. 权利要求1所述的枝顶孢霉菌在连作土壤的生物改良方面的应用。10. 根据权利要求9所述的枝顶孢霉菌在连作土壤的生物改良方面的应用，其特征在于 所述连作土壤中酸酸类物质的起始含量为0.5~50mg/kg 土壤。
【文档编号】C12N1/14GK105820962SQ201610307545
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】马小魁, 毛东霞, 吴玲玲, 李郁, 李亭亭, 刘陶
【申请人】陕西师范大学