一种用于检测甲状腺癌易感性相关的snp位点的引物及检测方法
【专利摘要】本发明提供一种用于检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点的引物，包括BRAF基因rs113488022位点引物、MSH2基因rs2303428位点引物、MLHI基因rs63750447位点引物、MBIP基因rs116909374位点引物和XRCC1基因rs1799782位点引物。采用该引物检测甲状腺癌易感性相关SNP位点的方法，包括以下步骤：(1)采集样品并提取DNA；(2)采用引物分别对目的片段序列进行PCR扩增；(3)对PCR产物进行纯化，测定其浓度和纯度；(4)纯化产物测序，并对SNP分型结果进行分析。该引物特异性好、灵敏度高、准确性好，检测方法简单，可预测受检者患甲状腺癌易感风险大小。
【专利说明】
一种用于检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点的引物及检测 方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测甲状腺癌易感性相关的SNP位 点的引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 甲状腺癌大约占所有恶性肿瘤的1 %，是内分泌器官癌症中发病率最高的一种，占 头颈部恶性肿瘤发病率的首位。据国际癌症学会资料统计，近年甲状腺癌在全球发病率逐 年上升，每年增长约4%。我国的甲状腺癌发病率在近30年来，也由约10/100万上升到约30/ 100万~40/100万。甲状腺癌成为备受关注的肿瘤之一，也是内分泌系统肿瘤领域的研究热 点。甲状腺癌和其它肿瘤一样，其发生、恶性程度的改变可能与众多癌基因、抑癌基因的突 变、激活、失活、缺失等相关。在多基因遗传病中，遗传基础是由多基因构成的，它部分决定 了个体发病的风险，同时环境对多基因遗传病产生较大影响，因此将遗传因素和环境因素 共同作用决定个体患某种遗传病的风险称为遗传易感性，疾病的遗传易感性检测已经成为 全世界科学研究的热点。基因作为遗传物质是影响遗传易感性的主要因素，因此对疾病相 关基因进行易感风险检测可提前预知疾病的遗传易感性，其中采用单核苷酸多态性(SNP) 作为基因组标志的关联分析方法较常见，是理想的遗传标志，它有遗传稳定性强，易于检测 的特点。但可用于检测甲状腺癌易感风险的BRAF基因rsl 13488022位点、MSH2基因 rs2303428 位点、MLHI基因rs63750447 位点 MBIP基因rs 116909374 位点和 XRCC1基因 rsl799782位点及其各位点的引物并未见报道。
【发明内容】
[0003] 针对于现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种用于检测甲状腺癌易感性相 关的SNP位点的引物及检测方法，可为甲状腺癌相关基因多态性检测提供可靠的结果，根据 检测结果评估个体患甲状腺癌的风险几率，从而进行有效预防。
[0004] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0005] -种用于检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点的引物，包括BRAF基因rsll3488022 位点的引物、MSH2基因rs2303428位点的引物、MLHI基因rs63750447位点的引物、MBIP基因 rsll6909374位点的引物和XRCC1基因rsl799782位点的引物；
[0006] 其中，B R A F基因r s 1 1 3 4 8 8 0 2 2位点的上下游引物序列分别为5~ ATCTCACCTCATCCTAACAdlSEQ ID No:l)和S'-TGTGAATACTGGGAACTATG-SlSEQ ID No: 2)；
[0007] MSH2基因rs2303428位点的上下游引物序列分别为5Z-GGTATATTTGTCATGGCTTC-3' (SEQ ID No:3)和S'-TCTCACAGGACAGAGACATA-SlSEQ ID No:4);
[0008] MLHI基因rs63750447位点的上下游引物序列分别为5'-
[0009] TCTTATTCTGAGTCTCTCCAC-SlSEQIDNodWP
[0010] 3'-AGAGAGAAGATGCAAGTGAT-5' (SEQ ID No:6);
[0011] MBIP基因rsll6909374位点的上下游引物序列分别为5'-
[0012] GATAAACTCAAGGACCAAAC-SlSEQIDNoJWP
[0013] S'-CCTCTTGAGAAGGAAGTAAA-S7(SEQ ID No：8)；
[0014] XRCC1基因rsl799782位点的上下游引物序列分别为5'-
[0015] CTATCTATGGGACACAGAAT-SlSEQIDNoJWP
[0016] 37-CCTAATTCGACAATACTGAC-57(SEQ ID No：10)〇
[0017] 采用上述引物检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，包括以下步骤：
[0018] (1)采集样品并提取其基因组DNA;
[0019] (2)采用所述的五种引物分别对目的片段进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行琼 脂糖凝胶电泳，电泳结果经过凝胶成像仪观察可见片段大小符合要求，无非特异条带；
[0020] (3)对步骤(2)PCR产物采用磁珠法进行纯化，将纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳，电 泳结果经凝胶成像仪观察可见单一、明亮的条带，然后进行定量检测；
[0021] (4)将步骤(3)中的纯化产物采用ABI公司3730型测序仪测序，并对SNP分型结果进 行分析。
[0022]本发明提供的一种用于检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点的引物及检测方法， 具有以下几种有益效果：
[0023] (1)本发明提供的引物可以实现特异性检测，具有稳定、特异性好的特点。
[0024] (2)本发明还提供了一种检测甲状腺癌易感性相关SNP位点的方法，该检测方法简 单，通过使用特异性的引物，对目的片段序列进行PCR扩增，然后通过测序可准确的测定人 甲状腺癌易感基因中的多态性位点基因型，其检测结果具有特异性好，灵敏度高，准确性好 等优点，根据基因型结果预测受检者患甲状腺癌的风险几率，并针对性地采取有效预防措 施进行预防，尽可能规避或者延迟疾病的发生，这对甲状腺癌的预测和预防具有重大意义。
【附图说明】
[0025] 图1为不同受检者血液DNA样品在5种不同引物下的PCR扩增电泳图；其中，1、2、3孔 为BRAF基因rsll3488022位点的引物扩增出的条带;4、5、6孔为MSH2基因rs2303428位点的 弓丨物扩增出的条带;7、8、9孔为MLHI基因rs63750447位点的引物扩增出的条带；10、11、12孔 为MBIP基因rsl 16909374位点的引物扩增出的条带；13、14、15孔为XRCC1基因rsl799782位 点的引物扩增出的条带。
[0026] 图2为BRAF基因rsll3488022位点的测序峰图；
[0027] 图3为MSH2基因rs2303428位点的测序峰图；
[0028] 图4为MLHI基因rs63750447位点的测序峰图；
[0029] 图5为MBIP基因rsll6909374位点的测序峰图；
[0030] 图6为XRCC1基因rsl799782位点的测序峰图；
【具体实施方式】 [0031] 实施例1
[0032] 1、样品的采集及其全基因组DNA的提取
[0033]用EDTA-K2抗凝管随机采集健康人的外周血3.0mL(随机选择3个受检者），根据 TIANamp Blood DNA Kit试剂盒要求提取受检者全基因组DNA，获得的全基因组DNA使用超 微量蛋白核酸分析仪(柏精BioDropyLite)检测其浓度以及纯度，记录原始数据，将浓度和 纯度都达到要求的DNA置于-20°C冰箱保存备用。
[0034] 2、目的基因的PCR扩增、纯化和测序
[0035] 用BRAF基因rsll3488022位点的引物、MSH2基因rs2303428位点的引物、MLHI基因 rs63750447位点的引物、MBIP基因rsl 16909374位点的引物和XRCC1基因rsl799782位点的 引物分别对所提取的DNA进行目的片段PCR扩增，反应体系为50yL，引物情况见表1，PCR反应 体系见表2所示；
[0036]表1引物名称、序列及产物长度
[0038] 表2PCR反应体系
[0040] PCR 扩增程序为:95°C 预变性 10min，94°C 变性 158,54°(：退火158,72°(：延伸3〇8，进 行30个循环，最后72°C延伸30min，于4°C保存，过夜需放置_20°C冷冻；
[0041 ] PCR扩增结束后，取5yL扩增产物，1 %琼脂糖凝胶电泳，电泳30min，染色20min，然 后将凝胶块置于凝胶成像仪中观察，电泳图如图1所示;PCR扩增程序结束后对产物进行纯 化：采用Mag-Bind Oligonucleotide Purification Kit试剂盒，并按试剂盒要求进行操 作；
[0042] 上样测序:采用ABI公司BigDye 3. lSequencing Kit试剂盒，并按试剂盒要求进行 操作；用ABI公司3730型测序仪进行测序；
[0043] 通过Chromas序列分析软件，将测序结果与标准序列进行比对，寻找SNP位点，通过 分析SNP位点处碱基的类型，就可以得到SNP位点的基因型，SNP分型结果如图2、图3、图4、图 5和图6所示。
[0044]结果分析：
[0045]由图1可知，每个基因的引物扩增的条件相同，即它们的TM值(DNA的解链温度）是 固定的，不会随目的基因的序列不同而导致TM值不同，且扩增后的条带单一且明显，说明本 发明提供的引物特异性好。
[0046] BRAF基因rsll3488022位点的非易感基因型为TT，易感基因型为TC和CC，由图2可 知，BRAF基因rsll3488022位点的基因型为TT，说明该样品的该位点基因型为非易感基因 型。
[0047] MSH2基因rs2303428位点的非易感基因型为TT，易感基因型为TC和CC，由图3可知， MSH2基因rs 2303428位点的基因型为CC，说明该样品的该位点基因型为易感基因型。
[0048] MLHI基因rs63750447位点的非易感基因型为TT，易感基因型为TA和AA;由图4可 知，MLHI基因r S63750447位点的基因型为AA，说明该样品的该位点基因型为易感基因型。
[0049] MBIP基因rsll6909374位点的非易感基因型为CC，易感基因型为CT和TT;由图5可 知，MBIP基因rsll6909374位点的基因型为CC，说明该样品的该位点基因型为非易感基因 型。
[0050] XRCC1基因rsl799782位点的非易感基因型为CC，易感基因型为CT和TT;由图6可 知，XRCC1基因rs 1799782位点的基因型为CT，说明该样品的该位点基因型为易感基因型。
[0051] 本发明定义的测序稳定性体现在测序结果上，测序结果直接与引物特异性、测序 模板纯度、反应体系等有关，引物特异性好才会保证模板进行特异性的扩增，保证有可供测 序的模板，同时模板纯度是测序准确性的保证，纯度不高导致测序峰位很低甚至不能判读 的情况，纯度太高则会出现一段很高的峰位后突然降低的谱形，使测序长度变短;本发明提 供的引物及方法保证了测序稳定，结果如图2-6,峰位一致，无干扰峰，无重叠峰，充分体现 了测序稳定，因此，通过本发明提供的基因相关位点SNP的检测，判断其确切基因型，能够评 估个体患甲状腺癌的风险几率，从而对加强甲状腺癌的预防具有重要的意义。
[0052] SEQUENCE LISTING <】10>成都中创清科医学检验所有限公司 <120> ?种用于检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点的引物及检测力法 <130 2016 ，1K)、- 10 < 17(卜 PaLentln version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 -400 > 1 atctcaccte atcetaacac 2(1 <210> 2 <211> 20 <212> DMA <213>人工序列 <400> 2 igigaaiaci gggaacLalg 20 <210> 3 <211〉 20
[0053] <212> DNA <213> 人工序列 <400> 3 ggtatatttg tcatggettc 2.0 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <40()> 4 tctcacagga cagagacata 20 <210> 5 <2!1> 21 <212> DNA <213>人工序列 <400> 5 tcttattctg agtctctcea c 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <2B>人工序列
[0054] <400> 6 agagagaaga tgcaagtgat 20 <210> 7 、21 卜 20 <212> DNA <213>人丁序列 <400'> 7 gataaactca aggaccaaac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400> 8 cctcttgaga aggaagtaaa 20 <21Q> 9 <21i> 20 <212> DNA <213 >人丁.序列 <400> 9 ctatctatgg gacacagaat 20
[0055] <21Q> 10 〇ll> 2(? <212> DNA <2:13>人工序列 <400> 10 cctaattcga caatactgac :2G
【主权项】
1. 一种用于检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点的引物，其特征在于，所述引物包括 BRAF基因 rsl 13488022位点的引物、MSH2基因 rs2303428位点的引物、MLHI基因 rs63750447 位点的引物、MBIP基因 rsll6909374位点的引物和XRCC1基因 rsl799782位点的引物； 其中，B R A F基因 r s 1 1 3 4 8 8 0 2 2位点的上下游引物序列分别为V -ATCTCACCTCATCCTAACAC-3'和3' -TGTGAATACTGGGAACTATG-5'; MSH2基因 rs2303428位点的上下游引物序列分别为5'-GGTATATTTGTCATGGCTTC-3'和 3,-TCTCACAGGACAGAGACATA-5,； MLHI基因 rs63750447位点的上下游引物序列分别为S'-TCTTATTCTGAGTCTCTCCAC-S'和 3,-AGAGAGAAGATGCAAGTGAT-5,； MBIP基因^116909374位点的上下游引物序列分别为5/-6六了44六(：11^4664〇^44(：-3 /和 3,-CCTCTTGAGAAGGAAGTAAA-5,； XRCC1基因 rsl799782位点的上下游引物序列分别为S'-CTATCTATGGGACACAGAAT-S'和 3'-CCTAATTCGACAATACTGAC-5'。2. 采用权利要求1所述的引物检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特 征在于，包括以下步骤： (1) 米集样品并提取其基因组DNA; (2) 采用所述的五种引物分别对五种目的片段序列进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进 行琼脂糖凝胶电泳； (3) 对步骤(2)PCR产物采用磁珠法进行纯化，将纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳并观察， 然后进行定量检测； (4) 将步骤(3)中的纯化产物采用测序仪测序，并对SNP分型结果进行分析。3. 根据权利要求2所述的检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在 于，步骤（2)中PCR扩增体系为：Primer STAR Max 25yL、Primer F 3yL、Primer R 3yL、DNA 模板100_150ng，用ddH2〇补足体积至50yL。4. 根据权利要求2所述的检测甲状腺癌易感性相关的SNP位点多态性的方法，其特征在 于，步骤(2)中PCR扩增反应条件为:95 °C预变性1 Omin，94 °C变性15 s，54 °C退火15s，7 2 °C延 伸30s，进行30个循环，最后72°C延伸30min，于4°C保存。
【文档编号】C12Q1/68GK105821144SQ201610357347
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】李江林, 张蓉, 刘月, 马明
【申请人】成都中创清科医学检验所有限公司