一种桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法，该方法在相同条件下培养，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适pH值为6.0?7.5，最适装液量范围为100?125mL。该优化条件的获得为高效解磷微生物的应用提供技术支撑。
【专利说明】
一种桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法
技术领域
[0001] 本发明属于微生物生态学技术领域，涉及一种桑树根际高效解无机磷细菌的培养 方法。
【背景技术】
[0002] 磷是植物生长必需的营养元素之一，是植物体内许多重要有机化合物的组分，同 时又以多种方式参与植物体内各种新陈代谢，对植物的生长发育起重要的作用。世界上绝 大多数土壤缺乏活性磷，土壤中95 %-99 %的磷无无效形式，植物很难直接吸收利用。
[0003] 土壤中存在大量能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用形态的微生物， 即解磷菌或称溶磷菌。有人把其中能够矿化有机磷化合物的称之为解有机磷微生物，将能 够把植物难以吸收利用的无机磷酸盐转化为可直接吸收利用形态的微生物，称之为解无机 磷微生物。利用微生物的解磷作用能够将难溶性的磷酸盐转化为可溶性磷。土壤中的解磷 微生物一方面具有活化难溶性磷的作用，另一方面还具有促进地上作物生长的效果，对于 农业生产具有重大的理论和实践意义。许多研究表明，利用解磷细菌制成的菌肥施入土壤 后，不仅能够提高土壤有效磷含量，而且能够提高土壤中硝化细菌和其它有益微生物的活 性，改善根部营养，能够提高水稻、小麦、玉米、莴苣、甘蓝等农作物的产量。且前苏联、加拿 大、印度、日本等国已将解磷菌制成解磷肥料或菌剂应用于生产。
[0004] 目前，我国农业生产主要通过施入无机磷肥的施肥方式来补充植物对磷的需求， 但是植物对磷肥的利用率却很低，因此长期施用化学磷肥，一方面会导致大量磷素在土壤 中积累，造成磷资源的浪费，另一方面引起土壤中各种养分的失衡，最终将会影响植物的生 长。而解磷细菌可以将难溶性磷转化为植物可以直接吸收利用的可溶性磷，提高磷肥利用 率，尤其是植物根际解磷细菌对植物生长起到一定程度的促生作用。利用解磷细菌制成生 物菌肥具有重大的开发应用价值。现有技术中还没有一种最优培养条件的桑树根际高效解 无机磷细菌的培养方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种桑树根际高效解无机磷细 菌的培养方法，从桑园土壤中分离到3株高效解无机磷细菌菌株，并采用摇瓶发酵法确定了 该3株菌株的最适培养条件，为高效解无机磷细菌的应用提供理论依据和技术支撑。
[0006] -种桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法，包括以下步骤：
[0007] 步骤1:高效解磷微生物的分离:从不同施肥桑树根际土壤中分离到3株高效解无 机磷细菌W1、W2、W3;
[0008] 步骤2:高效解无机磷细菌生长曲线的测定：3株供试菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂平 板培养基上28°C培养24h，挑取一环接种于30mL灭菌肉膏蛋白胨液体培养基中，于28°C 150r/min摇床上培养12h，制备成1 X 108cfu/mL悬浮菌液；
[0009] 在250mL的三角瓶中装入100mL的磷酸三钙无机磷培养基，灭菌冷却后；每瓶分别 接种lmL 1 108cfu/mL解无机磷细菌悬浮菌液，3次重复，于28 °C 150r/min摇床上培养，定时 取样，利用比浊法测定菌体生长量，绘制生长曲线；
[0010] 步骤3:碳源、氮源的筛选：以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇为碳源，以酵母粉、 牛肉膏、尿素、NH4N〇3、（NH 2)S〇4为氮源，在相同的条件下，将3株高效解无机磷细菌培养至稳 定期后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适碳源和氮源种类；
[0011] 步骤4:最佳pH值筛选:使用pH计调节磷酸三钙无机磷培养基的pH值为5.0~8.5， 以0.5为梯度设置8个pH值点，在相同的条件下，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后， 测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适pH值范围；
[0012] 步骤5:最佳装液量的确定：在250mL三角瓶中，分别装入25mL、50mL、75mL、100mL、 125mL、150mL、175mL、200mL的磷酸三钙无机磷培养基，在相同的条件下，将3株高效解无机 磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适装液量范 围。
[0013]优选地，所述磷酸三钙无机磷培养基为:葡萄糖10g，酵母粉0.5g，氯化钙0. lg，硫 酸镁0.25g，磷酸三，蒸馏水1000mL，pH 7.0，分装后灭菌30分钟。
[00?4]优选地，所述牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g， 琼脂15_18.(^，蒸馏水100011^4!17.0~7.5。
[0015]与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0016]本发明从不同施肥桑园土壤中分离到3株高效解无机磷细菌菌株，经Biolog微生 物鉴定系统（]^(31'〇3七&1：；[0111]\1，1]3八）鉴定为八(3；[1161：(^&(^61'匕&111]1&1111；[；[/^8341^61'(^&(^6『 cloacae ss dissolvens、Pantoea agglomerans bgp5,并对此3株菌株的最优培养条件进 行优化，确定了 3株菌株的最优培养条件，最适碳源为葡萄糖，最适氮源为硝酸铵，最适pH值 为6.0-7.5，最适装液量范围为100-125mL，为解磷细菌资源的利用提供理论依据。
【附图说明】
[0017] 图1是三株高效解无机磷细菌的生长曲线；
[0018] 图2是碳源对解无机磷细菌生长和解磷能力的影响，其中图2a为菌体的生长量，图 2b为菌株的解磷能力；
[0019] 图3是氮源对解无机磷细菌生长及解磷能力的影响，其中图3a为菌体的生长量，图 3b为菌株的解磷能力。
【具体实施方式】
[0020] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合附图和具体实例进一步阐述本发明。
[0021] -种桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法，包括以下步骤：
[0022] ①高效解磷微生物的分离:从不同施肥桑树根际土壤中分离到3株高效解无机磷 细菌W1、W2、W3，经Bio log微生物鉴定系统（MicroStation?，USA)鉴定为Acinetobacter baumannii/gs3、Enterobacter cloacae ss dissolvens、Pantoea agglomerans bgp5〇
[0023] ②高效解无机磷细菌生长曲线的测定：3株供试菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂平板培 养基上28°C培养24h，挑取一环接种于30mL灭菌肉膏蛋白胨液体培养基中，于28°C150r/min 摇床上培养12h，制备成1 X 108cfu/mL悬浮菌液。
[0024]在250mL的三角瓶中装入100mL的磷酸三钙无机磷培养基，灭菌冷却后；每瓶分别 接种lmL 1 X 108cfu/mL Acinetobacter baumannii/gs3、Enterobacter cloacae ss dissolvens及Pantoea agglomerans bgp5的细菌悬浮菌液，每个菌株3次重复，于28°C 150r/min摇床上培养，定时取样，利用比浊法测定菌体生长量，绘制生长曲线，如图1所示。
[0025] ③碳源、氮源的筛选：以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇为碳源，以酵母粉、牛肉 膏、尿素、NH4N03、（NH2) S〇4为氮源，每100mL接种lmL 108cf u/mL浓度的菌悬液，于28 °C 150r/ min摇床上培养，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和菌株的解 磷能力，从而筛选出最适碳源为葡萄糖(图2)，最适氮源为硝酸铵(图3)。
[0026] ④最佳pH值筛选:使用pH计调节磷酸三钙无机磷培养基的pH值为5.0~8.5，以0.5 为梯度设置8个pH值点，每100mL接种lmL 108cfu/mL浓度的菌悬液，于28°C150r/min摇床上 培养，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从 而筛选出最适pH值范围为6.0-7.5。
[0027]表1初始pH值对解无机磷细菌生长及解磷能力的影响
[0030] ⑤最佳装液量的确定：在250mL三角瓶中，分别装入25mL、50mL、75mL、100mL、 125mL、150mL、175mL、200mL的磷酸三钙无机磷培养基，每100mL接种lmL 108cfu/mL浓度的 菌悬液，于28 °C150r/min摇床上培养，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌体 的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适装液量范围为100-125mL。
[0031 ]表2装液量对解无机磷细菌生长及解磷能力的影响
[0033]所述磷酸三钙无机磷培养基为：葡萄糖10g，酵母粉0.5g，氯化钙O.lg，硫酸镁 0.25g，磷酸三，蒸馏水1000mL，pH 7.0，分装后灭菌30分钟。
[0034]所述牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基为:牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-18.0g，蒸馏水 1000mL，pH 7.0~7.5。
[0035]以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明 披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的 保护范围内。
【主权项】
1. 一种桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1:高效解磷微生物的分离:从不同施肥桑树根际土壤中分离到3株高效解无机磷 细菌 W1、W2、W3; 步骤2:高效解无机磷细菌生长曲线的测定：3株供试菌株在牛肉膏蛋白胨琼脂平板培 养基上28°C培养24h，挑取一环接种于30mL灭菌肉膏蛋白胨液体培养基中，于28°C150r/min 摇床上培养12h，制备成I X 108cfu/mL悬浮菌液； 在250mL的三角瓶中装入IOOmL的磷酸三钙无机磷培养基，灭菌冷却后；每瓶分别接种 ImL I 108cfu/mL解无机磷细菌悬浮菌液，3次重复，于28°C 150r/min摇床上培养，定时取 样，利用比浊法测定菌体生长量，绘制生长曲线； 步骤3:碳源、氮源的筛选：以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露醇为碳源，以酵母粉、牛肉 膏、尿素、NH4N〇3、（NH2)S〇4为氮源，在相同的条件下，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期 后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适碳源和氮源种类； 步骤4:最佳pH值筛选:使用pH计调节磷酸三钙无机磷培养基的pH值为5.0~8.5，以0.5 为梯度设置8个pH值点，在相同的条件下，将3株高效解无机磷细菌培养至稳定期后，测定菌 体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适PH值范围； 步骤5 :最佳装液量的确定：在25OmL三角瓶中，分别装入25mL、5OmL、75mL、10OmL、 125mL、150mL、175mL、200mL的磷酸三钙无机磷培养基，在相同的条件下，将3株高效解无机 磷细菌培养至稳定期后，测定菌体的生长量和菌株的解磷能力，从而筛选出最适装液量范 围。2. 根据权利要求1所述的桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法，其特征在于，所述磷 酸三钙无机磷培养基为:葡萄糖l〇g，酵母粉〇.5g，氯化钙O.lg，硫酸镁0.25g，磷酸三钙10g， 蒸馏水1000mL，pH 7.0,分装后灭菌30分钟。3. 根据权利要求1所述的桑树根际高效解无机磷细菌的培养方法，其特征在于，所述牛 肉膏蛋白胨琼脂平板培养基为：牛肉膏3g，蛋白胨IOg，氯化钠5g，琼脂15-18.0g，蒸馏水 1000 mUpH 7.0~7.5〇
【文档编号】C12N1/20GK105950510SQ201610367043
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】于翠, 胡兴明, 邓文, 李勇, 熊超, 莫荣利
【申请人】湖北省农业科学院经济作物研究所