一种提高桑黄活性成分含量的方法与流程

本发明涉及中药材，尤其涉及一种提高桑黄活性成分含量的方法。

背景技术：

桑黄是我国珍稀的药用真菌。桑黄别名猢狲眼、桑耳、桑臣等，是一种珍贵的大型药用真菌，其子实体可入药。因寄生于桑树而得名，桑黄在我国分布较广，主要生长在我国华北、东北、西北及四川、云南等地，在韩国和日本等一些东亚国家也均有生长，被誉为“森林黄金”，具有野生子实体数量少，人工栽培难度高的特点。传统中医药学将桑黄运用在血崩、血淋、闭经等疾病。现代药理学研究表明，桑黄在抗癌方面效果显著，除此之外，还有抗肺炎、降血脂、抗氧化以及保护肝脏等作用。是当今医药和食品工业共同研究和关注点。

随着桑黄药用价值的深入研究，市场对于桑黄的需求量逐年增加，造成了对桑黄子实体的破坏性开采，对于产地的保护意识淡薄，造成了子实体难以成型，资源日益枯竭，在我国的部分地区已难以寻找到桑黄的踪迹，大部分产区已岌岌可危。人工栽培难度较大，桑黄的开发和利用也因此受到限制。

液体发酵技术、固体培养技术和人工栽培技术是目前获得桑黄菌丝体和子实体主要的途径。目前，由于子实体规模化人工栽培技术尚不十分成熟，市场上大多采用液体发酵技术来获取桑黄子实体或非子实体产物，对活性成分的研究甚少。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种提高桑黄活性成分含量的方法，采用液体发酵的方式，通过对发酵条件进行优化，提高多糖和黄酮的含量。

技术方案：本发明所述的提高桑黄活性成分含量的方法，包括：将桑黄种子液接种于液体培养基中进行发酵，所述的液体培养基中含有碳源和氮源，所述的碳源为麦芽糖，所述的氮源为酵母提取物。

所述麦芽糖在液体培养基中的浓度为2-6％，优选为2-4％，更优选为2％。

所述酵母提取物在液体培养基中的浓度为0.1-0.4％，优选为0.2-0.4％，更优选为0.4％。

发酵时液体培养基中还含有MgSO₄·7H₂O 0.4-0.6‰，KH₂PO₄ 4.5-5‰。优选的，发酵时液体培养基中还含有MgSO₄·7H₂O 0.5‰，KH₂PO₄ 4.6‰。

上述浓度是指质量分数。

所述桑黄种子液的制备方法为：将桑黄菌种活化后接种于PDA液体培养基，27-29℃摇床中以150-170r/min培养6-7d。

发酵时，接种量为9-10％。

所述发酵的温度为27-29℃，摇床转速为150-170r/min，时间为6-9d。优选的，所述发酵的温度为28℃，摇床转速为160r/min，时间为7d。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明采用液体发酵的方式，通过对发酵条件进行优化，提高多糖和黄酮的含量。桑黄的生长条件在0.2％麦芽糖为碳源，0.4％酵母提取物为氮源时，多糖和黄酮含量可以获得较高值。

附图说明

图1为实施例2不同碳源百分含量下桑黄多糖、黄酮含量；

图2为实施例2不同碳源百分含量下桑黄多糖、黄酮的总产量；

图3为实施例3不同氮源百分含量下桑黄多糖、黄酮含量；

图4为实施例3不同氮源百分含量下桑黄多糖、黄酮总产量。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

桑黄的液体发酵方法，包括：

(1)菌种活化

将桑黄菌种接种在PDA固体培养基上，放置在28℃恒温培养箱中培养14d，用于液体培养的接种。

(2)桑黄一级种制备

将配置好的PDA液体培养基分装到三角瓶中，每瓶装100mL，高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min后使用。在无菌条件下，用直径为6mm的无菌打孔器在已活化的固体培养基上打孔，挑选8片菌种片放入PDA液体培养基中，接种后将三角瓶放入28℃摇床中以160r/min培养7d，获得桑黄一级种。

(3)发酵

在超净工作台中无菌条件下，使用种子打碎机将发酵生长成的一级菌种打碎，按10％(v/v)的接种量接入用于发酵的液体培养基的三角瓶中，pH自然，放置在摇床中以28℃，转速160r/min的发酵条件培养7d。

多糖含量的测定方法如下：

多糖的制备：桑黄菌种接种至液体培养基，发酵培养至菌丝球充满培养基后过滤，用60目筛子滤去培养基，用蒸馏水洗涤，放置在无纺布上60℃干燥，得干菌丝体，研磨成粉，称重。精确称取0.05g的菌丝体，浸泡于5mL 1mol/L的NaOH溶液中，于100℃水浴提取1小时，所得的提取液即为多糖粗品。

标准曲线的制作：称取干燥(恒温干燥箱60摄氏度，6小时)至恒重的葡萄糖10mg，放置于100ml的容量瓶，加去离子水定容，即为0.1mg/ml的葡萄糖标准液。精密吸取葡萄糖标准液0mL，0.2mL，0.4mL，0.6mL，0.8mL，1mL，1.2mL，1.4mL，1.6mL分别加入到各具塞试管中，用去离子水补足每管2ml，各管加入1ml的6％苯酚，迅速摇匀。再加入5ml的浓硫酸，放入时不要沿管壁加入，直接添加有利于浓硫酸快速与样品混合，静置10分钟，100℃水浴15分钟。取出后放置到室温，在490nm波长处测量各管吸光度。以试管溶液中的糖浓度为横坐标，各试管分别测得的吸光度为纵坐标，作标准曲线。试剂空白为参比。

桑黄多糖的含量测定：采用苯酚硫酸法测定桑黄多糖的含量。精密称取桑黄多糖0.02mL，用去离子水补足至2mL即为供试品溶液，加入试剂量和操作方法和标准曲线的制作相同，在分光光度计上测量其吸光度，根据标准曲线，计算多糖含量。

黄酮含量的检测方法如下：

黄酮的萃取：称取研磨成粉的桑黄菌丝0.05g，加入5mL70％乙醇，放置在超声波清洗仪中提取1h，获得萃取液。

桑黄黄酮的含量测定：定量移取样品液1mL于25mL容量瓶中，加入30％乙醇补充至10mL，加入5％NaN0₂ 0.2mL摇匀，静置5分钟，加入0.2mL 10％A1(N0₃)₃静置6分钟后，加2mL 4％NaOH，加入70％乙醇补充至50mL，510nm波长处进行比色测定，试剂空白为参比。

芦丁/乙醇标准曲线的测定：精密称取30mg芦丁，用70％乙醇配制50ml芦丁标准液。精密吸取芦丁标准液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别加入到各具塞试管中，各加5％NaNO₂溶液0.2mL，摇匀，放置6min；而后各加10％Al(NO3)3溶液0.2mL，摇匀放置6min；然后加4％NaOH溶液2mL，加70％乙醇定容至5mL，于510nm处测吸光度，做标准曲线。计算各样品的黄酮含量。

实施例2不同百分比的碳源试验

试验方法：实施例1的步骤(3)中，液体培养基含不同百分比的碳源(培养基配方为：麦芽糖，酵母提取物2g，蛋白胨2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄4.6g，去离子水1L)，不同百分比的碳源液体培养基中，麦芽糖的含量分别为0.5％、1％、2％、4％、6％。将配置好的不同百分比的碳源液体培养基分装到三角瓶中，每瓶100ml，用封口膜封口，再用橡皮筋扎紧。每个百分比做3个重复，高压蒸汽灭菌锅121℃下灭菌30min。其他步骤同实施例1，考察碳源对桑黄生物活性(多糖和黄酮)的影响。

试验结果：

碳源是真菌最重要的营养成分。它是碳水化合物和蛋白质的基本组成元素，又是重要的能量来源，在相同碳源的不同百分比的液体培养基中，麦芽糖的百分含量分别为0.5％、1％、2％、4％、6％。将已接种的培养基以28℃、160r/min培养7d，检测菌丝体的多糖含量和黄酮含量，结果如图1、表1。

表1 不同碳源百分含量下桑黄多糖和黄酮含量的差异显著性

如图1、表1所示，桑黄菌种在几个含有不同碳源百分比的培养基中均能生长，但不同碳源对菌丝多糖及黄酮含量的影响有显著差异。培养基含有2％的麦芽糖时桑黄菌株中的黄酮和多糖含量较高，而在麦芽糖含量为4％和6％时菌丝体中的多糖浓含量较高，但黄酮含量较低。在检测多糖和黄酮含量的同时，对多糖和黄酮的总产量也进行了计算，如图2、表2。

表2 不同碳源百分含量下桑黄多糖和黄酮总产量的差异显著性

如图2、表2所示，麦芽糖含量在2％时，多糖和黄酮的总产量较高，在4％和6％含量下多糖含量虽然高，但是黄酮总产量较2％时要低，所以认为，选取2％碳源含量为培养桑黄的最佳碳源百分含量。

实施例3不同百分比的氮源试验

试验方法：实施例1的步骤(3)中，液体培养基含不同百分比的氮源(培养基配方为：麦芽糖20g，酵母提取物，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 4.6g，去离子水1L)，在不同百分比的氮源液体培养基中，酵母提取物的百分含量分别为0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.2％。将配置好的不同百分比的氮源液体培养基分装到三角瓶中，每瓶100ml，用封口膜封口，再用橡皮筋扎紧。每个百分比做3个重复。高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min。其他步骤同实施例1，考察氮源对桑黄生物活性(多糖和黄酮)的影响。

试验结果：

氮源主要是指成分中含有较多氮的物质，主要用以真菌合成蛋白质、氨基酸等物质。大部分真菌可以有效地利用有机氮为自身提供营养。氮元素对桑黄的生长有益处。在相同氮源的不同百分含量的培养基中，酵母提取物的百分含量分别为0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.2％。用相同条件培养桑黄菌种，对获得的菌丝球进行多糖和黄酮含量测定，结果如图3、表3。

表3 不同氮源百分含量下桑黄多糖和黄酮含量的差异显著性

从图3、表3中可以看出，在酵母提取物含量在0.2％和0.4％时，多糖和黄酮含量较高，较之其他氮源含量有显著差异。为了对比得出氮源浓度的优劣，对多糖和黄酮的总产量也进行了计算，结果如图4、表4。

表4 不同氮源百分含量下桑黄多糖和黄酮总产量的差异显著性

如图4，表4所示，可以看出氮源百分含量在0.4％时，桑黄多糖和黄酮的总产量均高于其他百分比，所以，选择0.4％作为桑黄发酵的最适氮源。

在培养温度为28℃、摇床转速为160r/min、发酵时间为7d的条件下，以桑黄菌丝多糖和黄酮含量为指标，研究得出，2％麦芽糖为碳源最适百分比，0.4％酵母提取物为氮源最适百分比，多糖和黄酮的含量可以达到较高值。