专利名称：一株发酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的内生真菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株内生真菌。
背景技术：
北五味子[Schisandra chinensis (Turcz. ) Baill.],木兰科植物五味子的干燥成熟果实，是既食又药功能性保健食品。北五味子的活性成分是以五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素等为代表的木脂素类成分，该类成分具有明显的抗癌、抗炎、镇静，抗焦虑，保护肝细胞，抗化学性肝损伤、抗菌等作用，现广泛应用于医药和食品行业。由于北五味子需求量上涨，森林面积逐渐减少以及盲目的采挖，使北五味子资源面临考验，目前北五味子是国家三级重点保护的濒危药用植物。发酵技术可以改变或增强食品的某些活性，保护食品中某些活性成分，节省资源，为食品、药品活性成分的获得提供新方法。关于北五味子发酵的相关研究目前未见报道。
发明内容
本发明提供了一株发酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的内生真菌。本发明发酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的内生真菌，它为黑曲霉(Aspergillus niger)WJl，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No:M2012044，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日；它在PDA固体培养基上培养，菌丝初为白色，后变成黑色厚绒状，背面无色，菌株顶部形成球状顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，上长有成串黑褐色球状分生孢子，孢子直径3. 5 y m，分生孢子头球状，褐黑色。本发明中发酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的内生真菌，它为黑曲霉(Aspergillus niger) WJl,依据《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》,可见WJl菌株的菌落特征和孢子形态与曲霉菌特征极为相近。本发明中发酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的内生真菌，它为黑曲霉(Aspergillus niger) WJl,其ITS序列提交至NCBI网页,通过Blast搜索与所得到的序列相似性高的序列，并通过MEGA5. 03软件构建系统进化树，WJl菌株的ITS序列与曲霉属菌黑曲霉(Aspergillus niger)菌株的相似性达到了 99%以上,结合形态学观察结果,确定WJl菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)。本发明发酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的内生真菌，它为黑曲霉(Aspergillus niger) WJ1，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No:M2012044，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本发明采用分离自北五味子的内生真菌WJl发酵北五味子，以北五味子中4种主要木脂素成分为指标，比较其发酵前后此4种主要活性成分的动态变化，旨在增强北五味子的活性和提高木脂素成分含量，为高效利用北五味子，节省药源、开发新型功能性保健食品提供依据。本发明发酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的内生真菌，它为黑曲霉(Aspergillus niger) WJl,它能使北五味子中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素等主要活性成分显著提高，因此在以获得五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素为目的的原料生产中可以选择五味子内生真菌WJl发酵五味子以提高得率，节省药源。
图I为具体实施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的菌落形态图；图2为具体实施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的菌落形态图；图3为具体实施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的菌落形态图；图4为具体实施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的PCR扩增的电泳图，其中M泳道表示Marker，WJl泳道表示WJl ；图5为具体实施方式
一中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl的系统进化树图；图6为具体实施方式
一中混合对照品的HPLC色谱图，其中I表示五味子醇甲，2表不五味子酯甲，3表不五味子甲素和4表不五味子乙素；图7为具体实施方式
一中北五味子的HPLC色谱图，其中I表示五味子醇甲，2表示五味子酯甲，3表不五味子甲素和4表不五味子乙素；图8为具体实施方式
一中WJl发酵后的五味子HPLC色谱图,其中I表不五味子醇甲，2表不五味子酯甲，3表不五味子甲素和4表不五味子乙素。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式发酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的内生真菌，它为黑曲霉(Aspergillus niger)WJ1，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No :M2012044，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本实施方式中黑曲霉(Aspergillus niger) WJl，它在PDA固体培养基上培养，菌丝初为白色，后变成黑色厚绒状，背面无色，菌株顶部形成球状顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，上长有成串黑褐色球状分生孢子，孢子直径3. 5 y m，分生孢子头球状，褐黑色(如图1、2和3所示)。本实施方式中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl，其生长温度为28°C，生长pH值自然。本实施方式中黑曲霉(Aspergillus niger)WJl,该菌株分离自健康的药用植物北五味子植株的根茎，采自黑龙江省帽儿山地区，并经黑龙江省中医研究院付克治研究员鉴定为木兰科植物五味子属Schisandra Chinensis (Turcz. ) Baill.的植株,样本现存于黑龙江大学生命科学学院生物制药实验室；它按以下步骤进行分离培养(I)材料预处理选取健康北五味子的根茎用自来水冲洗干净后以无菌滤纸吸干水分，切成0. 5cm小段，备用；(2)表面消毒于无菌超净台内将健康北五味子的根茎按下述方法进行表面消毒75%酒精浸泡3 次氯酸钠浸泡15min-无菌水冲洗4次。用无菌手术刀将样品从中间切开，分别置于马铃薯固体分离培养基和马铃薯液体分离培养基中，28°C恒温培养箱和摇床中培养，待其边缘及顶端长出菌丝后，及时挑取菌落转移到相应的培养基中；(3)阴性对照取最后一次冲洗北五味子的无菌水涂布培养平板(马铃薯固体分离培养基)或取适量此冲洗液倒入马铃薯液体分离培养基内作对照，另将消毒后的实验材料在平板(马铃薯固体分离培养基)上滚动一周作对照，于相同的条件下培养；(4)菌体培养将消毒后的实验材料分别置于马铃薯固体分离培养基和马铃薯液体分离培养基中，于28°C培养箱中培养3-7d，待实验材料周围长出菌体，挑取菌体转入平板(马铃薯固体分离培养基)上多次划线分离纯化，将纯化后的菌株于斜面固体培养基上培养，4 °C保存备用。马铃薯液体分离培养基马铃薯培养基(PDA):每L由200g的马铃薯、20g的蔗糖和余量的水组成，pH自然，121°C高压灭菌30min ;其中马铃薯去皮，切成小块煮沸30min，用6层纱布过滤。马铃薯固体分离培养基马铃薯培养基(PDA):每L由200g的马铃薯、20g的蔗糖，16g的琼脂粉和余量的水组成，pH自然，121°C高压灭菌30min ;其中马铃薯去皮，切成小块煮沸30min，用6层纱布过滤。斜面固体培养基取5mL马铃薯固体培养基装于试管中，121°C高压灭菌30min后，铺成斜面冷却，以备保存菌种。试验用主要仪器设备和试剂见表I ;表I
权利要求
1.一株发酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的内生真菌，其特征在于它为黑曲霉(Aspergillus niger) WJl,已在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCC No:M2012044，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。
全文摘要
一株发酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的内生真菌，它涉及一株内生真菌。发酵北五味子提高北五味子主要活性成分含量的内生真菌，它为黑曲霉(Aspergillus niger)WJ1，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NoM2012044，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本发明黑曲霉(Aspergillus niger)WJ1能使北五味子中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素等主要活性成分显著提高，因此在以获得五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素为目的的原料生产中可以选择五味子内生真菌WJ1发酵五味子以提高得率，节省药源。
文档编号C12N1/14GK102628018SQ20121012623
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月26日 优先权日2012年4月26日
发明者刘玉洁, 郑春英, 陆欣媛 申请人:黑龙江大学