一种柑橘果皮的基因瞬时表达方法
【专利摘要】本发明提供一种柑橘果皮的基因瞬时表达方法，通过柑橘不同组织器官RNA的提取和cDNA的合成；通过将外源目的基因搭载到pGreen II 002962?SK载体上电转到农杆菌GV3101::pSoup中，结合渗透液配方，以及独特的注射手法和严格的对照，分析柑橘果皮瞬时表达。本发明方法设计合理，操作方便简单，能快速将多年生果树柑橘的基因进行同源功能验证，可以为多年生果树的基因同源功能验证提供新思路和方法。本方法同样适用于其他果实的瞬时表达研究。
【专利说明】
一种柑橘果皮的基因瞬时表达方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及一种柑橘果皮的基因瞬时表达方法，可用于 多年生果树基因功能同源验证。
【背景技术】
[0002] 柑橘属于芸香科（Rutaceae)柑橘亚科（Aurantioideae)，分为枳属（Poncirus Raf)、金柑属(Fortnoella Swing)和柑桔属(Citrus L·)，是世界第一大果树种类，其种植 面积和产量均居首位，也是我国原产水果之一。柑橘果肉风味独特且具有抗癌和抗肿瘤等 营养功能，并且柑橘果皮富含芳香物质和天然色素，是研究挥发性物质和色素代谢及其调 控相关基因的良好材料。
[0003] 基因功能验证可以分为两种情况，一种是通过增强其表达，取得表达产物进行研 究；另一种是减弱或者终止其表达，观察整体功能的变化，进而推测相应基因的功能。目前， 柑橘主要是通过遗传转化的方法将外源基因过量导入柑橘体内。植物遗传转化实际上是一 个组织培养和再分化的过程，其操作复杂、耗时较长、对实验员技术要求高，再加上柑橘属 于多年生木本植物，具有童期长、基因高度杂合、多胚性和以及性器官败育等生物学特性， 其遗传转化的高效再生体系不完善，转化效率及再生效率都很低，这些都使柑橘遗传转化 受到极大的限制。此外，从获得转基因抗性芽到成苗的过程周期长、难度大。
[0004] 植物瞬时表达系统是引入的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合，这些 DNA随载体进入细胞后12h内就可以表达，并持续约80h左右。它具有简单快速、表达水平高 和安全有效等优点。多年生果树常采用此方法进行相关基因同源功能验证，但是目前柑橘 相关基因研究较少用柑橘果实材料进行过量表达，可能是因为表达载体、农杆菌菌株、以及 表达体系等原因导致。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种柑橘果皮的基因瞬时表达方法，来克服现有柑橘遗传转 化方法存在的操作复杂、周期长、难以获得阳性转基因植株等方面的不足，解决柑橘果皮相 关基因的同源功能验证，为多年生果树的基因同源功能验证提供新思路和方法。
[0006] 本发明提供的一种柑橘果皮的基因瞬时表达方法，通过以下步骤实现：
[0007] 1. RNA的提取和cDNA的合成:柑橘不同组织器官(茎、叶、花、果实）总RNA的提取采 用CTAB法进行，并使用TURBO DNase (Ambion，美国）去除基因组DNA污染，再取1. Oyg RNA用 iScript cDNA Synthesis Kit(Bi〇-Rad，美国）逆转录成cDNA备用，其中柑橘RNA的提取采 用不同组织器官分别为茎、叶、花、果实的混合样品，去DNA后逆转录成cDNA。
[0008] 2.表达载体构建：基于甜橙和克林曼丁柑橘基因组数据库（http:// WWW.citrusgenomedb.org)，通过注释并利用已报道的拟南芥AP2/ERF家族基因序列进行 BLAST(TBLASTN和BLASTP)分析获得与叶绿素降解相关的CUERF13全长序列（SEQ:N0.1)。利 用PCR技术，结合引物对SEQ:N0.2和SEQ: N0.3扩增获得该基因，并采用测序手段进一步验 证。根据已确认的CitERF13(SEQ:N0.1)660bp全长序列和全长扩增引物SEQ:N0.2和SEQ : 腸.3扩增该基因的开放阅读框。以柑橘混合〇0嫩为模板，参照1?〇(3116公司？38七3七31'1:!^区11 Fidelity PCR System进行PCR扩增，其中30μ1 PCR体系为：10XBuffer 3yl，dNTP 2·4μ1， 上/下游引物各〇 · 6μ1，酶Ο · 15μ1，DEPC-H20 22 · 5μ1，cDNA Ο · 75μ1; PCR程序为：95°C预变性 5min;95°C 变性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin，35 个热循环；72°C 延伸 10min，4°C 保 存。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳回收后连接于Promega公司的pGEM-T easy载体上，ΙΟμΙ 连接体系为:载体ΙμL，Τ4连接酶ΙμL，缓冲液5μ1，回收产物3μ1，16°C过夜连接。将重组质粒 采用热激法导入大肠杆菌DH5a感受态细胞中，用不含任何抗生素的液体LB培养基(购自上 海生工生物工程股份有限公司，配方为胰蛋白胨l〇.〇g，酵母粉5.0g，NaCl lO.Og)于37°C 150rpm培养lh后，均勾涂布于含lOOyg ml/1氨节青霉素的固体LB培养基(配方为胰蛋白胨 l〇.〇g，酵母粉5.0g，NaCl lO.Og，琼脂糖15.0g)上初步筛选，用T载体通用引物(SEQ:N0.4和 SEQ:N0.5)对阳性克隆采用Takara公司的exTaq酶进行菌液PCR验证后测序。经测序获得序 列正确的阳性克隆再采用NEB公司限制性内切酶Spe I和Not I进行双酶切，产物再次电泳回 收，然后连接到经相同限制性内切酶处理的pGreenn〇029 62-SK表达载体上，重组质粒转 化入大肠杆菌DH5a感受态细胞后经50yg ml/1卡那霉素筛选，用pGreenn〇029 62-SK表达载 体自带的检测引物（SEQ:NO. 6和SEQ:NO. 7)对阳性克隆菌液PCR后测序再验证。将最终确认 正确构建的表达载体电转化入GV3101: :pSoup农杆菌感受态细胞中，涂布到含25yg ml/1庆 大霉素和50yg ml/1卡那霉素的固体LB培养基上，28°C培养48h，挑取阳性克隆菌液PCR验证。 将验证成功的阳性克隆在3ml含25yg ml/1庆大霉素和50yg ml/1卡那霉素的液体LB中， 200rpm，28 °C培养24h后，用终浓度20 %灭菌甘油保存阳性克隆，存放于-80 °C备用。
[0009] 3.柑橘果皮瞬时表达分析:将保存于-80°C的甘油菌划线接种于含25yg ml/1庆大 霉素和50yg ml/1卡那霉素的固体LB培养基上，28°C培养48h进行菌落活化，随后挑取小部分 活化后的菌落涂布于新的含以上两种抗生素的固体LB培养基上继续28°C培养12h，接着将 活化两次的农杆菌收集到渗透液（10mMMES，10mMMgCl 2，150mM乙酰丁香酮，pH5.6)中，调 整其浓度为〇D600 = 0.75备用。挑选一定数量大小均匀、色泽一致且无机械伤病虫害的果实 进行基因瞬时表达实验。先将注射器针头修剪到果皮厚度长度，防止菌液注射不进或注射 进入果肉，分别取lml调整过浓度的含目的基因或对照的菌液用带针头的注射器分别注射 同一个果实的赤道面对立部位，通过缓慢推动注射器来使菌液渗入果皮并使其扩散面积最 大化。注射5d后，与对照相比，注射CUERF13的果皮叶绿素降解明显增强。收集农杆菌渗透 区域果皮组织样品，检测发现，注射CUERF13的果皮叶绿素含量显著低于阴性对照 [0010]本发明利用甜橙和克林曼丁柑橘基因组数据库得到CUERF13全长序列，然后应用 普通PCR技术对电子克隆到的序列进行验证，再利用pGreen II 0029 62-SK表达载体，结合 渗透液配方（1〇1^1^3，10禮1%(：12，15〇1111乙酰丁香酮，？!15.6)，以及独特的注射手法和严 格的对照(带针头的注射器分别注射到同一个果实的赤道面对立部位），得出一种柑橘果皮 相关基因瞬时表达方法。本发明方法设计合理，操作方便简单，能快速将多年生果树柑橘的 基因进行同源功能验证，可以为多年生果树的基因同源功能验证提供新思路和方法。本方 法同样适用于其他果实的瞬时表达研究。
【附图说明】
[0011]附图1:外源基因 CitERF13(SEQ:N0.1)在甜橙果皮中的表达，箭头所指方向为注射 口位置
[0012]附图2:外源基因 Ci tERFl 3 (SEQ: NO. 1)在栊柑果皮中的表达，箭头所指方向为注射 口位置。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合附图和具体实施例，以外源基因 CUERF13在甜橙和栊柑果皮中的表达为 例，对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。
[0014] 下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》(第三版）。
[0015]实施例1:柑橘果皮CUERF13基因在甜橙果皮中瞬时表达
[0016] 1. RNA的提取和CDNA的合成:柑橘不同组织器官(茎、叶、花、果实）总RNA的提取采 用CTAB法进行，并使用TURBO DNase (Ambion，美国）去除基因组DNA污染，再取1. Oyg RNA用 iScript cDNA Synthesis Kit(Bi〇-Rad，美国）逆转录成cDNA备用，具体操纵按说明书进 行。
[0017] 2.表达载体构建：基于甜橙和克林曼丁柑橘基因组数据库（http:// WWW.citrusgenomedb.org)，通过注释并利用已报道的拟南芥AP2/ERF家族基因序列进行 BLAST (TBLASTN和BLASTP)分析获得与叶绿素降解相关的Ci tERF 13 (SEQ: NO. 1)。利用PCR技 术，结合引物对SEQ:N0.2和SEQ:N0.3扩增获得该基因，并采用测序手段进一步验证。根据已 确认的CitERF13(SEQ:N0.1)660bp全长序列和全长扩增引物SEQ:N0.2和SEQ:N0.3扩增该基 因的开放阅读框。以柑橘不同组织器官（茎、叶、花、果实）混合cDNA为模板，参照Roche公司 FastStart High Fidelity PCR System进行PCR扩增，其中30μ1 PCR体系为：10 XBuffer 3 μl，dNTP2·4μl，上/下游引物各0·6μl，酶0·15μl，DEPC-H20 22·5μl，cDNA0·75μl;PCR程序 为：95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin，35 个热循环；72°C 延 伸lOmin，4°C保存。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳回收后连接于Promega公司的pGEM-T easy载体上，10μ1连接体系为:载体ΙμL，T4连接酶ΙμL，缓冲液5μ1，回收产物3μ1，16°C过夜 连接。将重组质粒采用热激法导入大肠杆菌DH5a感受态细胞中，用不含任何抗生素的液体 LB培养基(购自上海生工生物工程股份有限公司，配方为胰蛋白胨lO.Og，酵母粉5.0g，NaCl 10.Og)于37°C 150rpm培养lh后，均匀涂布于含lOOyg ml/1氨苄青霉素的固体LB培养基(配方 为胰蛋白胨10. 〇g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，琼脂糖15.0g)上初步筛选，用T载体通用引物 (SEQ: N0.4和SEQ: N0.5)对阳性克隆采用Takara公司的exTaq酶进行菌液PCR验证后测序。经 测序获得序列正确的阳性克隆再采用NEB公司限制性内切酶Spel和Notl进行双酶切，产物 再次电泳回收，然后连接到经相同限制性内切酶处理的pGreenn〇029 62-SK表达载体上， 重组质粒转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞后经50yg mL-1卡那霉素筛选，用pGreen Π 0029 62-SK表达载体自带的检测引物(SEQ: NO. 6和SEQ:NO. 7)对阳性克隆菌液PCR后测序再验证。 将最终确认正确构建的表达载体电转化入GV3101: :pSoup农杆菌感受态细胞中，涂布到含 25yg ml/1庆大霉素和50yg ml/1卡那霉素的固体LB培养基上，28°C培养48h，挑取阳性克隆 菌液PCR验证。将验证成功的阳性克隆在3ml含25yg ml/1庆大霉素和50yg ml/1卡那霉素的 液体LB中，200rpm，28 °C培养24h后，用终浓度20 %灭菌甘油保存阳性克隆，存放于-80 °C备 用。
[0018] 3.柑橘果皮瞬时表达分析:将保存于-80 °C的甘油菌划线接种于含25yg ml/1庆大 霉素和50yg ml/1卡那霉素的固体LB培养基上，28°C培养48h进行菌落活化，随后挑取小部分 活化后的菌落涂布于新的含以上两种抗生素的固体LB培养基上继续28°C培养12h，接着将 活化两次的农杆菌收集到渗透液（10mMMES，10mMMgCl 2，150mM乙酰丁香酮，pH5.6)中，调 整其浓度为〇D600 = 0.75备用。
[0019]盛花期后150d的甜橙果实于采后当天抵运实验室，挑选一定数量大小均匀、色泽 一致且无机械伤病虫害的果实进行后续实验。先将注射器针头修剪到果皮厚度长度，防止 菌液注射不进或注射进入果肉，将盛有lml菌液的注射器针头插入果皮，缓慢推动注射器使 菌液渗入果皮并使扩散最大化。每次实验中，都要设计严格的阴性对照，即注入含pGreen II 0029 62-SK对照的农杆菌菌株渗透液，目的基因和阴性对照注射部位为同一个果实的 赤道面对立部位。注射5d后，果皮表型和叶绿素含量如附图1，与对照相比，注射CUERF13的 果皮叶绿素降解明显增强。收集农杆菌渗透区域果皮组织样品，检测发现，注射CUERF13的 果皮叶绿素含量显著低于阴性对照。
[0020] 实施例2:柑橘果皮CUERF13基因在栊柑果皮中瞬时表达
[0021] 整个步骤同实施例1，注射果实为栊柑果皮。
[0022]采取盛花期后160d的栊柑果实进行瞬时表达实验。注射5d后，果皮表型和叶绿素 含量如附图2,与对照相比，注射CUERF13的果皮叶绿素降解明显增强。收集农杆菌渗透区 域果皮组织样品，检测发现，注射CUERF13的果皮叶绿素含量显著低于阴性对照 [0023]本发明利用柑橘基因组数据库分离得到与叶绿素降解相关的CUERF13,将其搭载 到pGreen II 0029 62-SK表达载体上，并导入农杆菌GV3101::pSoup中，结合渗透液配方 (1〇11^1^3，1〇11^1^(：1 2，15〇11^乙酰丁香酮，？!15.6)，以及独特的注射手法和严格的对照 (带针头的注射器分别注射到同一个果实的赤道面对立部位），得出一种柑橘果皮相关基因 瞬时表达方法，为多年生果树的基因同源功能验证提供新思路和方法。
【主权项】
1. 一种柑橘果皮的基因瞬时表达方法，其特征在于，通过以下步骤实现： (1) RNA的提取和cDNA的合成：柑橘不同组织器官混合样品总RNA的提取采用CTAB法进 行，并使用TURBO DNase去除基因组DNA污染，再取l.Oyg RNA用iScript cDNA Synthesis Kit逆转录成cDNA备用； (2) 表达载体构建:基于甜橙和克林曼丁柑橘基因组数据库，获得SEQ:N0.1的CUERF13 全长序列，以柑橘不同组织器官混合cDNA为模板，结合全长扩增引物序列SEQ: NO. 2和SEQ: 繼.3，参照?&8七3七31'1：]^811?丨(161;^7?0?35^七61]1说明书配制?0?体系，按照其推荐的？0? 程序进行产物扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳回收后连接于pGEM-T easy载体上，将重 组质粒导入大肠杆菌DH5a感受态细胞中，在含l〇〇yg M/1氨苄青霉素的固体LB培养基上初 步筛选，用T载体通用引物序列SEQ: NO. 4和SEQ: NO. 5的菌液PCR后经测序获得序列正确的阳 性克隆，再将其质粒采用相应限制内切酶酶切，产物电泳回收，然后连接到经相同限制性内 切酶处理的pGreen Π 0029 62-SK表达载体上，重组质粒转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞后 经50yg mL-1卡那霉素筛选，用pGreen Π 0029 62-SK表达载体自带的检测引物序列SEQ: NO. 6 和SEQ: NO. 7对阳性克隆进行菌液PCR验证后测序再验证，将最终确认正确构建的表达载体 电转化入GV3101::pSoup农杆菌感受态细胞中，阳性克隆保存成甘油菌，存放于-80°C备用； (3) 柑橘果皮瞬时表达分析:将保存于-80°C的甘油菌划线接种于含25yg ml/1庆大霉素 和50yg ml/1卡那霉素的固体LB培养基上，28°C培养48h进行菌落活化，随后挑取小部分活化 后的菌落涂布于新的含以上两种抗生素的固体LB培养基上继续28°C培养12h，接着将活化 两次的农杆菌收集到渗透液中，调整其浓度为〇D600 = 0.75备用，挑选大小均匀、色泽一致 且无机械伤病虫害的果实，分别取lml调整浓度后的含目的基因或对照的菌液，分别注射同 一个果实的赤道面对立部位，注射5天后，与对照相比，注射CUERF13的果皮叶绿素降解明 显增强，收集农杆菌渗透区域果皮组织样品，检测发现，注射CUERF13的果皮叶绿素含量显 著低于阴性对照。2. 根据权利要求1所述的一种柑橘果皮瞬时表达方法，其特征在于，步骤（1)所述柑橘 不同组织器官混合样品是指茎、叶、花、果实的混合样品，去DNA后逆转录成cDNA。3. 根据权利要求1所述的一种柑橘果皮瞬时表达方法，其特征在于，步骤(2)中，表达载 体的构建是将CUERF13的开放阅读框采用高保真酶扩增最终搭载到pGreen II 0029 62-SK载体上，并通过电击法将其导入到农杆菌GV3101: :pSoup中用于后续实验。4. 根据权利要求1所述的一种柑橘果皮瞬时表达方法，其特征在于，步骤(3)中，农杆菌 活化次数为两次，收集菌体的渗透液配方为10mM MES，10mM MgCl2，150mM乙酰丁香酮，pH 5.6，菌液浓度调整为0D600 = 0.75。5. 根据权利要求1所述的一种柑橘果皮瞬时表达方法，其特征在于，步骤(3)中，所挑选 的果实大小均匀、色泽度一致且无机械伤病虫害，用带针头的注射器分别注射到同一个果 实的赤道面对立部位进行严格的对照试验。
【文档编号】C12N15/84GK105969798SQ201610290979
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】殷学仁, 陈昆松, 谢秀兰, 刘晓芬
【申请人】浙江大学