一个调控柑橘果皮脱绿的关键乙烯响应因子的制作方法
【专利摘要】本发明提供一个调控柑橘果皮脱绿的关键乙烯响应因子CitERF6(SEQ：NO.1)，该基因含有一个保守的AP2/ERF结构域和Pat4(RKRK)核定位信号。在柑橘果实采后乙烯处理过程中，CitERF6的表达受外源乙烯诱导增强。CitERF6在柑橘果皮中瞬时过量表达时，可促进叶绿素的降解，加快果皮脱绿。本发明利用PCR、实时定量PCR、柑橘果实瞬时表达技术，克隆并鉴定出柑橘乙烯响应因子CitERF6可参与调控叶绿素降解，可应用到植物颜色修饰的基因工程育种中，尤其在调控柑橘果皮脱绿中的应用。为进一步研究其作用机制和果皮着色技术提供理论依据。
【专利说明】
-个调控巧橘果皮脱绿的关键乙稀响应因子
技术领域
[0001] 本发明属于植物分子生物技术和基因工程领域，设及一个调控相橘果皮脱绿的关 键乙締响应因子(CUERF6)，W及在植物色泽修饰的基因工程育种和在调控相橘果皮脱绿 中的应用。
【背景技术】
[0002] 相橘属于芸香科（Rutaceae)相橘亚科（Aurantioideae)，分为积属（Poncirus Raf )、金相属(Fortnoella Swing)和相枯属(Citrus L.)，是世界第一大果树品种，其种植 面积和产量均居首位，也是我国原产水果之一。相橘果肉风味独特且具有抗癌和抗肿瘤等 功能，而果皮富含芳香物质和天然色素（叶绿素和类胡萝h素）。相橘果实常在绿熟期被采 收，为促使果实外观着色均匀，提高果品商品性和价值，商业上常采用乙締烟熏法或乙締利 浸薩法加速果皮叶绿素降解。
[0003] 叶绿素是地球生物圈中最丰富的色素，它既参与光合作用，又为动物和人类提供 食物，还具有造血、治病和解毒等功能。尽管叶绿素如此重要，但是它的降解发生在植物衰 老和果实成熟整个过程中，并且还受环境刺激，如极端光照、低溫和乙締等。正因为如此，叶 绿素的降解不仅造就了运个窠纷多彩的世界，而且增加了大多数果实的商品性，如相橘、香 蕉、雜猴桃、番茄和梨等。
[0004] 乙締作为一种重要的植物激素，参与植物生长发育的整个过程，同时也是果实成 熟进程中最重要的调控者之一。它能促进果实软化、糖分累积和酸的降解、芬芳物质的散发 和果皮脱绿。乙締响应因子化RF)位于乙締信号转导途径的末端，其序列中含有一个AP2/ ERF结构域，可转录调控各种乙締响应的目标基因，进而产生广泛的乙締生物学效应。但是 在相橘果皮脱绿过程中，ERFs家族成员调控叶绿素降解的生物学机制尚不清楚。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一个调控相橘果皮脱绿的关键乙締响应因子(CUERF6)，其 核巧酸序列如SEQ:N0.1所示。
[0006] 本发明的另一个目的是提供所述的乙締响应因子(CUERF6)在植物色泽修饰的基 因工程育种中的应用，尤其是在调控相橘果皮脱绿中的应用。研究表明，本发明提供的相橘 乙締响应因子CitERF6(SEQ:N0.1)可调控叶绿素降解，因此可应用到植物色泽修饰的基因 工程育种和调控相橘果皮脱绿中。
[0007] 本发明提供的乙締响应因子(CitERF6)的特征功能如下：
[000引 1.基因序列特征
[0009 ]从已报道的拟南芥A P 2 / E R F基因与相橘基因组数据库（h t t P : / / WWW. c i trusgenome化.org)进行BLAST (TBLASTN和BLASTP)分析获得Ci 巧RF6 (沈Q: NO. 1)。利 用PCR技术，结合引物对SEQ: NO. 3和SEQ: NO. 4扩增得到该基因，并采用测序手段进一步验 证。序列分析结果显示，该基因含有一个保守的AP2/ERF结构域，该结构域具有DNA结合功 能，属于ERF转录因子家族，还含有一个化t4(服服)核定位信号，说明其在细胞中定位细胞 核内。
[0010]基因克隆中，将已报道的拟南芥AP2/ERF基因与相橘基因组数据库化ttp:// WWW. C i trusgenome 化.org)进行 BLAST (TBLASTN和 BLASTP)分析获得 Ci 巧 RF6，Ci 巧RF6 含有 一个化t4(服服)核定位结构域由60-70个氨基酸组成的AP2/ERF结构域，具有DNA结合功能。 [00川 2.基因表达特征
[001^ 运用实时定量PCR(QPCR)技术，W相橘e-actin(SEQ:N0.7)作为内参（QPCR引物对 为沈Q:NO. 8和沈Q: NO. 9)，利用引物对沈Q: NO. 10和沈Q: NO. 11分析不同相橘样品中Ci巧RF6 表达模式。实验结果显示，在纽荷尔厮澄果实采后乙締处理材料中，与空气处理相比，经乙 締处理的采后椎相果实，4化后相橘色泽指数(CCI)明显上升，而叶绿素含量则显著降低。与 之一致的是，CUERF6的表达受到外源乙締的显著增强，且在处理4h时即出现表达高峰，先 于果皮叶绿素的降解。
[0013] 基因表达分析中，实时定量PCR检测数据采用相对定量AACt的方法，将纽荷尔厮 澄乙締处理初始点(Oh)的表达量设为1，结果显示与空气处理相比，经乙締处理的采后椎相 果实4她后相橘色泽指数(CCI)明显上升，叶绿素含量则显著降低，CUERF6的表达受到乙締 诱导而显著增强，且在处理地时即出现表达高峰，先于果皮叶绿素的降解。
[0014] 上述基因表达结果说明CitERF6参与了相橘果皮叶绿素的降解过程，可调控相橘 果皮的脱绿。
[001引 3.基因功能特征
[0016] 利用引物对沈Q: NO. 3和沈Q: NO. 4，结合PCR技术克隆Ci巧RF6 (SEQ: NO. 1)的开放性 阅读框，搭载到pGreen II 0029 62-SK载体上，构建成Ci巧RF6-SK重组表达载体，并通过电 击法将其导入到农杆菌GV3101: : pSoup中。W椎相为试材，将含有Ci巧RF6-SK和空表达载体 的农杆菌菌株分别注射到相橘果皮中，培养5天后结果显示Ci巧RF6在椎相果皮中瞬时过量 表达时，可促进其叶绿素的降解，加快果皮脱绿，表现在CCI值的上升和叶绿素含量的降低。 Ci巧W6的运一功能可应用于修饰植物色泽的基因工程育种和调控相橘果皮脱绿中。
[0017] 基因功能分析中，表达载体的构建是将Ci巧W6的开放阅读框采用Roche公司高保 真酶扩增搭载到pGreen II 0029 62-SK载体上，并通过电击法将其导入到农杆菌GV3101:: pSoup中用于后续实验。
[001引基因功能分析中，应用渗透液（lOmM MgCl2、10mM MES、150mM乙酷下香酬、pH为 5.6)将含有Ci巧RF6-SK或空表达载体的农杆菌菌株调整为00600 = 0.75，用带针头的注射器 分别注射到同一相橘果实果皮的赤道面对立部位，其结果显示过量表达5天后，注射含有 Ci巧W6基因菌液后其果皮颜色CCI值更高，颜色更偏黄色，叶绿素含量更低。
[0019] 该基因在其他方面的应用同样属于本发明专利的保护范畴。
[0020] 本发明利用相橘基因组数据库化1：1口:/7懸￥.(3；[化113邑6]101116化.0'邑)信息，结合纽 荷尔厮澄采后乙締处理材料中ERF基因表达量的变化，W及在相橘果皮中瞬时过量表达的 表型，得出1个与相橘果皮脱绿相关的ERF基因 Ci巧RF6(SEQ:N0.1)，为进一步研究其作用机 制和果皮着色技术提供理论依据。
【附图说明】
[0021] 图1是纽荷尔厮澄采后乙締处理CCI和叶绿素含量变化w及Ci巧RF6和CitERFS在 其处理下的表达模式。纽荷尔厮澄采后乙締处理CCI(A)、叶绿素含量变化（B)、CitERF6 (SEQ:N0.1)在其处理下的表达模式(C)W及CitERF8(SEQ:N0.2)在其处理下表达模式(D)。 LSD代表最小显著差异法。
[0022] 图2是CitERF6在椎相果皮中过量表达及其CCI和叶绿素含量变化。CitERF6(SEQ: 肋.1)在椎相果皮中过量表达表型（4)、此1(8)^及叶绿素含量变化（〇。巧<0.05，**口< 0.01。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和具体实施例，W不具有调控相橘果皮脱绿的Ci巧RF8(SEQ:N0.2)， W及Ci tERF6 (SEQ: NO. 1)为例，对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范 围。
[0024] 下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》(第=版）。
[00巧]实施例1:基因克隆
[0026] 基于相橘甜澄和克林曼下基因组数据库化ttpV/Ww.citrusgenomedb.org)获得 CUAP2/ERF基因家族成员。一方面直接根据注释下载可能属于AP2/ERF的基因，另一方面通 过已报道的拟南芥AP2/ERF基因进行BLAST (TBLASTN和BLASTP)分析，将运两种方式所获得 的序列利用AP2/ERF保守结构域进行一一筛选，再用CAP3序列装配程序（http:// pbil.univ-lyonl.fr/cap3.地 P)去除重复序列，获得 Ci 巧 RF6(沈 Q:N0.1)和Ci 巧 RF8(SEQ: NO.2)。
[0027] 结合引物对沈Q:N0.3和沈Q:N0.4,及SEQ:N0.5和SEQ:N0.6,利用PCR技术，分别扩 增所得两个基因，其中30山PCR体系为：10XBuffer化l，dNTP 2.化1，上/下游引物各0.化 1，酶 0.15iil，DEPC-此 0 21.化l，50mM MgS〇4 1.化l，cDNA 0.75iil;PCR 程序为：95°C 预变性 5min;95°C 变性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 lmin，35 个热循环;72°C 延伸 10min，4°C 保 存。PCR产物采用测序手段（Invitrogen)进一步验证。
[002引实施例2:基因表达分析 [0029](-)实验方法
[0030] 1.果实材料收集
[0031] 盛花期后150天的厮澄果实采后当天抵运实验室，挑选大小均匀，成熟度相对一致 的果实开展试验。将果实随机分成两组(每组100个），每组平均放置于3个密闭容器，一组通 4化L ? [1乙締气体12h，而另一组通空气12h，然后转货架放置于20°C环境。分别于0,4,8，12 和4她取样。每次取9个果实，分为3个生物学重复。
[0032] 2.相橘果皮色泽指数(CCI)的测定:采用色差计MiniScan XE Plus化unterLab，美 国）测定，计算公式为CCI = 1000 X a*/L* X b*。
[0033] 3.叶绿素含量测定：叶绿素提取采用80%丙酬分S次抽提，每次抽提后于4°C， 12000 X g离屯、5分钟吸取上清液，最后定容至10ml体积，用分光光度计测定其663皿和645皿 吸光度值，计算公式为：畑1 a(mg/ml) = 9.78 X A663-0.99 X A64日；Chi b(mg/mL) = 21.4 X A645 - 4.65XA663 0
[0034] 4.RNA提取:相橘果皮切成下后迅速用液氮冷冻，保存于-80°C备用。提取RNA时，称 取Ig冻样加液氮充分研磨后，加入到有4ml 65°C预热的CTAB/e-琉基乙醇提取缓冲液的离 屯、管中，满旋混合使细胞彻底破裂，65°C加热3-5min;然后向离屯、管中加入4ml氯仿:异戊醇 (24:1)抽提液，充分满旋混合；15 °C 1000化pm离屯、lOmin，吸取上清液到新的离屯、管，重新抽 提一次;得到的上清液小屯、吸取到新的离屯、管中，加入1/4体积的lOmol/1的LiCl，4°C放置 过夜；第二天，4°C100(K)rpm离屯、20min，倒掉上清液，将离屯、管倒置于纸巾上W去除多余的 溶液;加入40化1 65 °C SSTE，溶解沉淀;再加入40化1氯仿:异戊醇(24:1)抽提液，满旋混合； 将液体彻底吸入1.5ml离屯、管中20°C 1000化pm离屯、lOmin，吸上清液到新的离屯、管中加入2 倍体积的-20°C预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，-80°C放置30min W上;4 °C 1000化pm离屯、 25min，倒掉上清液，短暂离屯、后吸出残余液体，将沉淀在通风楓惊干(约5-lOmin);每管加 入20iU DEPC水溶解沉淀，得到总RNA样品；用1%琼脂糖凝胶电泳检测所得样品完整性，结 果显示样品有两条带，亮度为上条:下条= 2:1，说明RNA样品完整无降解;用紫外分光光度 计检测所得样品纯度，吸取化1 RNA样品用49山DEPC水稀释后，检测OD26日和0〇28日，分析得到 0化6日/(脱8日=1.8-2.0，说明RNA纯度符合标准。根据公式OD260 X 40 (RNA浓度系数）X 50 (样品 稀释倍数)即可计算出样品RNA的浓度(ng/iil)，进行下一步研究。
[0035] 5.CDNA 合成
[0036] 提取的总RNA采用TURBO面ase Kit(Ambion，美国）去除基因组DNA污染，取l.Oiig RNA按iScript cDNA Synthesis Kit(Bi〇-Rad，美国）逆转录成cDNA。
[0037] 6.基因表达分析:使用Primers在线软件化ttp: //打odo . wi .mit. edu/primerS/) 设计QPCR引物，W相橘e-actin(沈Q:N0.7)作为内参，引物为沈Q:N0.8和沈Q:N0.9，Ci巧RF6 引物为SEQ: NO. 10和SEQ: NO. 11，Ci巧RF8引物为沈Q: NO. 12和沈Q: NO. 13。QPCR反应体系为20 yl，含有 lOyl Ssofast EvaGreen S 叫 e;rmix(Bi〇-Rad，美国），上下游引物（lOuM， Invitrogen)各化 1，化 1 cDNA(23<Ct<24)，6iil DEPC-H2O,每次QPCR检测都包括不含反应模 板的阴性对照。QPCR反应程序为95 °C 3min; 95 °C 10s，60 °C 30s，45个循环;95 °C 10s;从65 °C到 95°C，每上升0.5°C读取一次巧光信号值。所用仪器为CFX96实时巧光定量PCR仪(Bio-Rad， 美国）。QPCR检测的数据采用相对定量A Act的方法，将纽荷尔厮澄乙締处理初始点(Oh)的 表达量设为1。
[003引（二)实验结果
[0039] 在纽荷尔厮澄采后乙締处理(4化L，l/i，12h，2(TC)材料中，乙締处理加速了果实 叶绿素降解，48h果实色泽指数CCI和叶绿素含量分别达到了-8.0和59.38g g-中W，而对照组 分别为-10.4和108.72g g-iFW(附图1A，B) Xi巧RF8不受乙締诱导，在乙締处理后表达水平 仍与空气处理保持相对一致，而Ci巧W6对乙締敏感，乙締处理4h后被诱导约6.80倍，（附图 1C，D)，说明其可能对相橘果皮脱绿有调控效应。
[0040] 实施例3:基因功能验证
[OOW (-)实验方法
[0042] 1.重组载体构建
[0043] 根据已验证的Ci巧RF6(SEQ:N0.1)全长序列设计引物(SEQ:N0.3和SEQ:N0.4)扩增 其开放性阅读框。W相橘果皮cDNA为模板，参照Roche公司高保真酶体系稍加改动，配制终 体积30山PCR体系：10XBuffer化l，dNTP 2.化1，上/下游引物0.化1，酶0.15山，DEPC-H20 21.化l，50mM MgS〇4 1.化l，cDNA 0.7化1。反应条件为：95°C预变性5min;95°C变性lOsec， 58°C退火5sec，72°C延伸2.5min，35个热循环;72°C延伸10min，4°C保存。PCR产物回收后连 接于pGEM-T easy载体，将重组质粒导入大肠杆菌D册a感受态细胞经培养筛选阳性克隆重 提质粒采用相应的限制性内切酶双酶切后重新连接到pGreen II 0029 62-SK表达载体上 克隆测序。将最终确认正确构建的表达载体通过电击导入GV3101: :pSoup农杆菌感受态细 胞中，菌液均匀涂布于含25μg/ml庆大霉素、5μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素的LB固体培 养基上筛选阳性克隆。用20%甘油保存于-80°C备用。
[0044] 2.相橘瞬时表达
[0045] 将存放于-80°C的甘油菌接种活化后，刮取生长良好的菌落，用lOmM MgCl2，lOmM MES(生物缓冲液），150mM乙酷下香酬，抑为5.6的渗透液悬浮，使其ODs日日为0.75。用带针头注 射器将渗透液注入相橘果皮，每次实验中，都要设计严格的阴性对照，即注入含pGreen II 0029 62-SK空载体的农杆菌菌株渗透液。注射5天后测定果皮菌液渗透区域的CCI后取样液 氮速冻，-80°C保存W备测定叶绿素含量所用。
[0046] (二)实验结果
[0047] Ci巧RF6(SEQ:N0.1)在相橘果皮中过量表达5天后，同一个果实注射含有CitERF6 基因菌液后其果皮颜色相对于注射空载体更黄，叶绿素降解更迅速，经测定其生理指标CCI 和叶绿素含量（附图2)，结果也证明过量表达Ci巧RF6后果皮叶绿素含量更低。综合上述结 果，表明Ci巧W6具有调控相橘果皮脱绿的功能。
[0〇4引本发明利用PCR、实时定量PCR、相橘果实瞬时表达技术，克隆并鉴定出相橘乙締响 应因子CitERF6(SEQ:N0.1)可调控叶绿素降解，可应用到植物颜色修饰的基因工程育种和 调控相橘果皮脱绿中。该基因在其他方面的应用同样属于本发明专利的保护范畴。
【主权项】
1. 一个调控柑橘果皮脱绿的关键乙烯响应因子，其特征在于，名称为CUERF6,其核苷 酸序列如SEQ:NO. 1所示。2. 根据权利要求1所述的一个调控柑橘果皮脱绿的关键乙烯响应因子，其特征在于，获 得CUERF6的特征步骤包括： (1) 基因克隆：将已报道的拟南芥AP2/ERF基因与柑橘基因组数据库（http:// www. citrusgenomedb. org)进行 BLAST 分析获得 CitERF6 和 Ci tERF8，核苷酸序列分别为 SEQ: NO. 1 和SEQ: NO. 2，结合引物对SEQ: NO. 3和SEQ: NO. 4，及SEQ: NO. 5和SEQ: NO. 6扩增所得两个 基因，并采用测序手段进一步验证； (2) 基因表达分析:应用实时定量PCR技术，以柑橘β-actin作为内参，序列为SEQ:N0.7， QPCR引物对为SEQ:NO. 8和SEQ:NO. 9，利用引物对SEQ:NO. 10和SEQ:NO. 11，以及SEQ:NO. 12和 SEQ: NO. 13，分析不同柑橘样品中Ci tERF6和Ci tERF8的表达模式，所有QPCR引物特异性经熔 点曲线分析、凝胶电泳分析和QPCR产物再测序验证； (3) 基因功能验证:利用引物对SEQ: NO. 3和SEQ: NO. 4，结合PCR技术克隆Ci tERF6的开放 性阅读框，搭载到pGreen II 0029 62-SK载体上，构建成CUERF6-SK重组表达载体，并通过 电击法将其导入到农杆菌GV3101: :pSoup中，以栊柑为试材，将含有CUERF6-SK和空表达载 体的农杆菌菌株分别注射到柑橘果皮中，培养5天后分别测定两种果皮菌液渗透区域的柑 橘色泽指数和叶绿素含量。3. 根据权利要求1所述的一个调控柑橘果皮脱绿的关键乙烯响应因子在植物色泽修饰 的基因工程育种中的应用，尤其是在调控柑橘果皮脱绿中的应用。
【文档编号】A01H5/08GK106047890SQ201610410029
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】陈昆松, 谢秀兰, 刘晓芬, 殷学仁
【申请人】浙江大学