一种快速制备黑米花青素矢车菊素-3-葡萄糖苷的方法
【专利摘要】本发明涉及从一种从黑米快速分离纯化黑米花青素矢车菊素?3?葡萄糖苷的方法。具体操作如下：将黑米除杂，浸泡，超微粉碎成浆；恒温浸提；离心分离，得到水提液；然后利用Fe3O4纳米粒子纯化，用有机溶剂洗脱，洗脱液即为花青素的纯化液，将纯化液通过纳滤膜浓缩，回收有机溶剂，将浓缩液冷冻干燥，得到花青素粉末，再通过制备型高效液相色谱进一步分离，得到只含有矢车菊素?3?葡萄糖苷的高纯度分离液；将分离液进行冷冻干燥，获得矢车菊素?3?葡萄糖苷粉末。本发明整个提取过程绿色、环保、无污染，纯化采用Fe3O4纳米粒子，洗脱试剂可以通过纳滤膜回收并循环使用；采用制备液相快速、高效分离纯化，最大程度地保留花青素单体不被破坏。
【专利说明】
一种快速制备黑米花青素矢车菊素-3-葡萄糖苷的方法
技术领域
[0001]本发明属于食品功能性天然产物的分离纯化技术领域，具体涉及一种从黑米中提取纯化花青素及矢车菊素-3-葡萄糖苷的快速分离方法。
【背景技术】
[0002]黑米又被称为血米、紫米、乌米，属于禾本科植物，其营养丰富，有“世界米中之王”和“黑珍珠”的美誉。每10g中含有蛋白质11.5g，比普通大米高出6.8%;脂肪2.7g，比大米高出1.9倍;富含维生素KB1、核黄素、硫胺素及铁、锌、铜、砸等微量元素。此外，黑米中还含有人类所需的氨基酸，其总含量高出普通大米15.9%，赖氨酸高出3-5倍，精氨酸高出2.12倍，更为重要的是黑米中氨基酸的模式更接近人体模式。黑米还是花青素的主要原料之一。花青素，又称花色素，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属类黄酮化合物，也是植物花瓣中的主要呈色物质，被誉为继水、蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素、矿物质之后的第七大必需营养素，是一种有机活性抗氧化物，具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血月旨、提尚免疫力等多种功效。
[0003]近年来，国内外对花青素的生理功能进行了大量的研究，且取得了丰硕的研究成果。研究发现，经常食用花青素可明显改善视力、缓解肝功能障碍、抑制肿瘤活性、减缓老年斑的沉积，而且具有抗氧化延缓衰老的功能。同时，花青素还是一种较为安全的天然色素。大量开发花青素，不仅可满足人们对其作为药物、化妆品及保健食品的需求，而且可替代对人体有害的人工合成色素的使用。
[0004]黑米富含花青素，其中矢车菊素-3-葡萄糖苷是黑米花青素的主要单体组分，约占黑米花青素含量的95%以上。花青素单体的提取和纯化是色素生产中的重要环节，目前已知的方法多以大孔树脂和葡聚糖凝胶为纯化介质，这些方法提取时间较长，纯化步骤繁琐，效益不高，且存在一定的环境污染等缺点。所以，市场上的花青素单体价格较高，这对其在食品、医药、化妆品、保健品等领域的广泛使用造成了直接的影响，无法满足广大消费者的直接需求。
【发明内容】
[0005]为了降低花青素单体的纯化成本，减少花青素提取过程对环境所造成的污染问题，本发明提供一种快速制备黑米矢车菊素-3-葡萄糖苷的方法。
[0006]—种快速制备黑米花青素矢车菊素-3-葡萄糖苷的方法的操作步骤如下:
(1)除去黑米中的杂质，用水浸泡0.5?3小时；
(2)将黑米和水按质量体积比IKg: 10?20 L，进行超微粉碎，得到细浆料；
(3 )对浆料进行恒温浸提，得到黑米浆液；
(4)将黑米浆液离心分离，得到花青素水提液；
(5)按体积质量体积比20?30ml:1g在花青素水提液中加入四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子，搅拌I小时以上，用磁铁将吸附有花青素的四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子吸出，用纯净水洗脱四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子表面不被其吸附的物质，再用有机溶剂洗脱，洗脱液即为花青素纯化液；
(6)将花青素纯化液通过纳滤膜浓缩，使体积浓缩到花青素纯化液体积的1/15，分别得到浓缩液和滤出液，滤出液即为步骤(5)所用有机溶剂；
(7)将浓缩液真空冷冻干燥，获得水分含量<5%的黑米花青素粉末；
(8)将黑米花青素粉末用酸液复原成浓缩液，通过制备型高效液相色谱仪进一步分离，得到只含有矢车菊素-3-葡萄糖苷的分离液；
(9)将分离液真空冷冻干燥，获得水分含量<5%的紫红色的矢车菊素-3-葡萄糖苷粉末，纯度可达到95%以上。
[0007]进一步限定的技术方案如下:
步骤(I)中，黑米在水中浸泡0.5?3小时。
[0008]步骤(2)中，所述细浆料中的物料的平均颗粒度小于50μπι。
[0009]步骤(3)中，用浓度0.5?5.0mol/Ι的柠檬酸溶液调节细浆料的pH为2.5?5.5，在20?55 °C下，浸提2?6小时。
[0010]步骤(4)中，采用碟片式离心机、在6000?10000转/分钟下，对黑米浆液进行固液分离，除去淀粉、蛋白质、多糖。
[0011]步骤(5)中，所述有机溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇、I，3_丙二醇、丙三醇、乙二醇中的一种，基于环境考虑，优选40?80%的乙醇溶液。
[0012]步骤(6)中，所述纳滤膜为截留分子量为200?300Da的纳滤膜；浓缩压力为0.8MPa、温度 20 ?45°C。
[0013]步骤(7)中，所述浓缩液进行预冷冻，然后在真空冷冻干燥机中，在真空度0.05?
0.1MPa、温度-20?-40°C条件下冷冻干燥。
[0014]步骤(8)中，所述制备型高效液相色谱仪洗脱条件为:流动相A为体积浓度10%的甲酸，流动相B为按体积比25ml: 10 ml:40 ml:25 ml的乙腈:甲酸:水:甲醇的混合溶液，采用C18柱梯度洗脱，流速为lml/min，40?85min内流动相B由16%升至85%，检测波长为520nm。
[0015]步骤(9)中，真空冷冻干燥条件是真空度0.05?0.1MPa、温度-20?_40°C。
[0016]本发明的有益技术效果体现在以下方面:
(I)对环境无污染
本发明采用的提取剂是水，整个提取过程无污染的化学试剂，纯化采用Fe3O4纳米粒子，有机溶剂洗脱富集后可以通过纳滤膜回收并循环使用，其它试剂对环境均无污染。该方法能有效地节省能源消耗并保护环境。
[0017](2)有效的保护花青素单体的稳定性
在整个提取、纯化过程中，采用中温(20?60°C)浸提;碟片离心除淀粉等;Fe3O4纳米粒子纯化;纳滤回收有机溶剂;冷冻干燥法干燥，条件温和，最大程度地保留花青素单体不被破坏。
[0018](3)纯化工艺采用膜分离技术
本研究采用纳滤膜分离回收有机试剂，不仅可以浓缩，而且技术能耗小，安全有效，工艺简单，操作也方便，自动化比较强。
[0019](4)黑米花青素纯化技术的突破长期以来，由于花青素的提取方法成本高、步骤繁琐、提取率低，制约了其在食品及其他相关领域中广泛的应用。通过本发明方法获得的花青素在经Fe3O4纳米粒子纯化后大大提高了其纯度和得率，有利于基于制备液相技术对其单体进行分离纯化，并且显著缩短了纯化时间，降低了传统柱分离的成本。
[0020](5)制备型液相色谱分离制备黑米花青素矢车菊素-3-葡萄糖苷
经制备液相一步分离纯化，可快速、高效地获得黑米花青素的高纯度单体。
【附图说明】
[0021 ]图1为黑米花青素矢车菊素-3-葡萄糖苷的制备液相图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例和附图，对本发明作进一步地描述。
[0023]实施例1
一种快速制备黑米花青素矢车菊素-3-葡萄糖苷的具体操作步骤如下:
(1)去杂、浸泡:除去黑米中肉眼可见的杂质，然后用水浸泡半个小时；
(2)超微粉碎:按质量体积比1:10(Kg/L)取黑米和水，进行超微粉碎，至料液的平均颗粒度小于50μηι;
(3)浸提:用浓度0.5mol/l的柠檬酸溶液调节细浆料的pH为4.5，在40°C下，浸提4小时，得到黑米浆液；
(4)离心分离:采用碟片式离心机，在8000转/分钟下，将黑米浆液进行固液分离，以除去淀粉、蛋白质、多糖，得到水提液；
(5)Fe304纳米粒子吸附花青素:在25ml花青素水提液中加入IgFe3O4纳米粒子，在500r/min条件下，磁力搅拌2.0h，直到大部分花青素被Fe3O4纳米粒子吸附;再用磁铁将吸附有花青素的Fe3O4纳米粒子吸出，先用纯净水洗脱不被Fe3O4纳米粒子吸附的物质，再用60%的乙醇溶液洗脱，洗脱液即为花青素纯化液；
(6)纳滤浓缩:将花青素纯化液通过截留分子量为200Da的纳滤膜浓缩，使体积浓缩到纯化液体积的1/15，并回收乙醇，操作压力0.8 MPa，温度25°C，分别得到浓缩液和滤出液，滤出液即为60%的乙醇溶液；
(7)真空冷冻干燥:将浓缩液进行预冷冻，然后放入真空冷冻干燥机中，在真空度
0.1MPa、冷冻干燥温度-25°C条件，冷冻干燥至水分含量彡5%，获得紫红色的黑米花青素粉末；
(8)制备矢车菊素-3-葡萄糖苷:将黑米花青素粉末用酸溶液复原，复原液通过制备型高效液相色谱仪进一步分离，所用的分离柱为C18柱，流动相A为体积浓度10%( V/V)的甲酸，流动相B为按体积比25ml: 10 ml:40 ml:25 ml的乙腈:甲酸:水:甲醇的混合溶液，流速为lml/min，50min内流动相B由16%升至85%，检测波长为520醒。由图1所示，主峰即为矢车菊素-3-葡萄糖苷，对其组分进行收集；
(9)真空冷冻干燥:将收集液进行预冷冻，然后放入真空冷冻干燥机中，在真空度
0.1MPa、冷冻干燥温度-25 °C条件，冷冻干燥至水分含量< 5%，获得紫红色粉末，即为矢车菊素-3-葡萄糖苷粉末。经检测，矢车菊素-3-葡萄糖苷粉末纯度为99.5%。
[0024]实施例2
一种快速制备黑米花青素矢车菊素-3-葡萄糖苷的具体操作步骤如下:
(1)去杂、浸泡:除去黑米中肉眼可见的杂质，然后用水浸泡半个小时；
(2)超微粉碎:按质量体积比1:20(Kg/L)取黑米和水，进行超微粉碎，至料液的平均颗粒度小于50μηι;
(3)浸提:用浓度1.5mol/l的柠檬酸溶液调节细浆料的pH为5.5，在55°C下，浸提6小时，得到黑米浆液；
(4)离心分离:采用碟片式离心机，在10000转/分钟下，将黑米浆液进行固液分离，以除去淀粉、蛋白质、多糖，得到水提液；
(5)Fe304纳米粒子吸附花青素:在30ml花青素水提液中加入IgFe3O4纳米粒子，转速300 r/min、磁力搅拌2.5h，直到大部分花青素被Fe3O4纳米粒子吸附；再用磁铁将吸附有花青素的Fe3O4纳米粒子吸出，先用纯净水洗脱不被Fe3O4纳米粒子吸附的物质，再用75%的乙醇溶液洗脱，洗脱液即为花青素的纯化液；
(6 )纳滤浓缩:将花青素的纯化液通过截留分子量为300Da的纳滤膜浓缩，使体积浓缩到纯化液体积的1/15，并回收乙醇，操作压力0.8 MPa，温度35°C，分别得到浓缩液和滤出液，滤出液即为75%的乙醇溶液；
(7)真空冷冻干燥:将浓缩液进行预冷冻，然后放入真空冷冻干燥机中，在真空度
0.05MPa、冷冻干燥温度-40 °C条件，冷冻干燥至水分含量彡5%，获得紫红色粉末，即为黑米花青素粉末；
(7)制备矢车菊素-3-葡萄糖苷:将花青素冻干粉用酸溶液复原，将浓缩液通过制备型高效液相色谱进一步分离，所用的分离柱为C18柱，流动相A为体积浓度10%( V/V)的甲酸，流动相B为按体积比25ml: 10 ml:40 ml:25 ml的乙腈:甲酸:水:甲醇的混合溶液，流速为lml/min，65min内流动相B由16%升至85%，检测波长为520nm对矢车菊素-3-葡萄糖苷组分进行收集；
(8)真空冷冻干燥:将分离液进行预冷冻，然后放入真空冷冻干燥机中，在真空度
0.05MPa、冷冻干燥温度-40°C条件，冷冻干燥至水分含量<5%，获得紫红色粉末，即为矢车菊素-3-葡萄糖苷粉末。经检测，矢车菊素-3-葡萄糖苷粉末纯度为98.7%。
【主权项】
1.一种快速制备黑米花青素矢车菊素-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于具体的操作步骤如下: (1)除去黑米中的杂质，用水浸泡0.5?3小时； (2)将黑米和水按质量体积比IKg: 10?20 L，进行超微粉碎，得到细浆料； (3 )对浆料进行恒温浸提，得到黑米浆液； (4)将黑米浆液离心分离，得到花青素水提液； (5)按体积质量体积比20?30ml:1g在花青素水提液中加入四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子，搅拌I小时以上，用磁铁将吸附有花青素的四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子吸出，用纯净水洗脱四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子表面不被其吸附的物质，再用有机溶剂洗脱，洗脱液即为花青素纯化液； (6)将花青素纯化液通过纳滤膜浓缩，使体积浓缩到花青素纯化液体积的1/15，分别得到浓缩液和滤出液，滤出液即为步骤(5)所用有机溶剂； (7)将浓缩液真空冷冻干燥，获得水分含量<5%的黑米花青素粉末； (8)将黑米花青素粉末用酸液复原成浓缩液，通过制备型高效液相色谱仪进一步分离，得到只含有矢车菊素-3-葡萄糖苷的分离液； (9)将分离液真空冷冻干燥，获得水分含量<5%的紫红色的矢车菊素-3-葡萄糖苷粉末，纯度可达到95%以上。2.根据权利要求1所述的一种快速制备黑米矢车菊素-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于:步骤(I)中，黑米在水中浸泡0.5?3小时。3.根据权利要求1所述的一种快速制备黑米矢车菊素-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述细浆料中的物料的平均颗粒度小于50μπι。4.根据权利要求1所述的一种快速制备黑米矢车菊素-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于:步骤(3)中，用浓度0.5?5.0mol/Ι的柠檬酸溶液调节细浆料的pH为2.5?5.5，在20?55°〇下，浸提2?6小时。5.根据权利要求1所述的一种快速制备黑米矢车菊素-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于:步骤(4)中，采用碟片式离心机、在6000?10000转/分钟下，对黑米浆液进行固液分离，除去淀粉、蛋白质、多糖。6.根据权利要求1所述的一种快速制备黑米矢车菊素-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于:步骤(5)中，所述有机溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇、I，3_丙二醇、丙三醇、乙二醇中的一种，基于环境考虑，优选40?80%的乙醇溶液。7.根据权利要求1所述的一种快速制备黑米矢车菊素-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于:步骤(6)中，所述纳滤膜为截留分子量为200?300Da的纳滤膜;浓缩压力为0.8 MPaj^度 20 ?45°C。8.根据权利要求1所述的一种快速制备黑米矢车菊素-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于:步骤(7)中，所述浓缩液进行预冷冻，然后在真空冷冻干燥机中，在真空度0.05?0.1MPa、温度-20?-40°C条件下冷冻干燥。9.根据权利要求1所述的一种快速制备黑米矢车菊素-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于:步骤(8)中，所述制备型高效液相色谱仪洗脱条件为:流动相A为体积浓度10%的甲酸，流动相B为按体积比25ml: 10 ml:40 ml:25 ml的乙腈:甲酸:水:甲醇的混合溶液，采用C18柱梯度洗脱，流速为lml/min，40?85min内流动相B由16%升至85%，检测波长为520nm。10.根据权利要求1所述的一种快速制备黑米矢车菊素-3-葡萄糖苷的方法，其特征在于:步骤(9)中，真空冷冻干燥条件是真空度0.05?0.1MPa、温度-20?-40°C。
【文档编号】C07H1/08GK106008626SQ201610359790
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】何述栋, 孙汉巨, 娄秋艳, 章萍萍, 王鑫, 操小栋, 叶永康, 王军辉, 何钱, 朱永生, 余敏
【申请人】合肥工业大学