矢车菊素-3-o-葡萄糖苷对1,3-二氯-2-丙醇的生殖毒性的干预作用
【专利说明】矢车菊素-3-0-葡萄糖苷对1, 3- 二氯-2-丙醇的生殖毒性的干预作用
技术领域
[0001]本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及矢车菊素-3-0-葡萄糖苷对1，3_ 二氯-2-丙醇暴露的R2C细胞生殖毒性的干预作用。
【背景技术】
[0002]近年来，食品中的污染物氯丙醇在全球范围内已经引起了越来越多的关注，自1999年在香港出口的酱油中调查出氯丙醇以后，对于这种化学污染物的调查研究更加引起人类的重视。氯丙醇广泛存在于食物中，尤其是酱汁和调味品如酱油和蚝油。目前已知氯丙醇可以产生于食品加工的各个环节中或存储过程中，其中在毒性水平方面，最重要的两种氣丙醇形式为1，3- —■氣-2-丙醇(1，3-DCP)和3-氣_1，2-丙—■醇(3-MCPD)。粮农组织/世卫组织联合专家委员会在1993年宣布，因为它的致癌性，I, 3-DCP不允许作为食品添加剂，在食品加工过程中应使其含量水平降低至最低。1，3-DCP被曝光为基因毒性致癌物。另外，I, 3-DCP已经被英国委员会评估为食品中的致癌性化学物质，可能是生物体的诱变物质，氯丙醇对人类的危害作用已经引起广泛关注。
[0003]有研究报道表明，1，3-DCP毒性作用的主要靶点是生殖系统和肾脏，如果长期摄入将导致生物体体重降低、雄性不育和肾功能衰退等一系列的危害作用，甚至会造成生命危险。此外，还有研究者针对它在生殖系统方面的危害作用展开了探索研究。本发明人在前期研究实验中发现1，3-DCP可以造成R2C细胞凋亡及功能的下降，并探索了引起这些反应的具体机制。总而言之，1，3-DCP具有肝、肾脏毒性、生殖系统毒性和致癌性，对人体和环境的危害不容忽视。
[0004]因此，对1，3_DCP危害机制以及防控措施的相关研究，具有重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是克服现有1，3-DCP的危害机制研究和防控措施的不足，提供矢车菊素-3-0-葡萄糖苷(C3G)的一种新应用，即C3G对1，3-DCP暴露的R2C细胞生殖毒性的干预作用，本发明研究表明，对于1，3-DCP所引起的R2C细胞形态损伤及凋亡现象，C3G能够起到明显的保护作用，同时，C3G对1，3-DCP暴露的R2C细胞孕酮分泌量具有显著的保护干预效果。
[0006]本发明上述目的通过以下技术方案实现:
矢车菊素-3-0-葡萄糖苷在制备预防和/或治疗1，3- 二氯-2-丙醇引起的生殖疾病的药物中的应用。优选地，所述生殖疾病是指雄性生殖疾病。
[0007]优选地，所述生殖疾病是指1，3- 二氯-2-丙醇对生殖细胞的生殖毒性。
[0008]更进一步优选地，所述生殖细胞为雄性生殖细胞。更优选地，所述雄性生殖细胞R2C细胞。
[0009]矢车菊素-3-0-葡萄糖苷在制备预防和/或治疗1，3- 二氯-2-丙醇所引起的生殖细胞损伤和/或生殖细胞凋亡药物中的应用。
[0010]矢车菊素-3-0-葡萄糖苷在制备抑制1，3- 二氯-2-丙醇所引起的生殖细胞孕酮分泌量减少的药物中的应用。
[0011]矢车菊素-3-0-匍萄糖苷在制备抑制1，3_ 二氯_2_丙醇所引起的生殖细胞ROS升高、MMP损伤和/或cAMP水平降低的药物中的应用。
[0012]矢车菊素-3-0-葡萄糖苷在制备上述药物中的应用均在本发明的保护范围之内。优选地，上述生殖细胞为R2C细胞。
[0013]本发明首先采用MTT法筛选1，3-DCP及C3G的作用浓度，并检测C3G对1，3-DCP的生殖毒性是否有抑制作用及起抑制作用的浓度梯度，通过MTT法筛选C3G的浓度范围区间，最终确定合适的浓度梯度；放射免疫法(rad1immunoassay，RIA)检测R2C细胞孕酮的合成和分泌情况来探索C3G对1，3-DCP暴露的R2C细胞的功能损伤是否有抑制作用；化学发光法(chemiluminescence，CL)检测细胞内活性氧(reactie oxygen species,R0S)以及环腺苷酸(cyclic adenosinemonophosphate，cAMP)的水平；流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡及线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)变化情况；Western blotting法检测StAR、3 β-HSD等在孕酮合成中起调控作用的蛋白表达量。
[0014]实验结果:ΜΤΤ结果表明，在初步确定的几个浓度中，其中2mmol/L的1，3-DCP能使细胞活性显著下降，在所选择的5、10、20、40ymol/L四个浓度中，当C3G浓度为10?40 ymol/L时，表现出对1，3-DCP生殖毒性的干预作用，能够显著降低1，3-DCP对细胞活性的损伤。细胞形态及细胞凋亡率结果表明，对于1，3-DCP所引起的细胞形态损伤及凋亡现象，C3G能够起到明显的保护作用。孕酮结果表明，1，3-DCP暴露下的R2C细胞孕酮量在4、24h时与对照组相比均显著降低，而20、40 μ mo I/L浓度的C3G对1，3-DCP暴露的R2C细胞孕酮分泌量具有显著保护干预效果。R0S、MMP及cAMP检测结果表明，C3G对于1，3-DCP引起的R2C细胞ROS变化、MMP损伤及cAMP水平变化均能起到一定的保护干预作用。Westernblotting结果，对R2C细胞孕酮合成途径中起关键作用的StAR、3 β -HSD的蛋白表达水平进行检测，I, 3-DCP组的StAR、3 0 -HSD水平均显著降低，而与1，3-DCP组相比，20 μ mol/L C3G干预后的StAR蛋白及20、40 ymol/L C3G干预后的的3 β -HSD蛋白的表达量均显著升高。
[0015]有上述实验结果我们得出以下结论:C3G对1，3-DCP暴露的R2C细胞中cAMP具有显著促进，同时通过降低R2C细胞中ROS水平来抑制细胞内MMP下降，而促进cAMP表达和抑制MMP的下降可以促进将胆固醇从线粒体膜外向膜内转运，并提高1，3-DCP暴露的R2C细胞孕酮合成通路中的关键调节蛋白StAR、3 β-HSD的表达进而促进孕酮合成。C3G可能通过保护MMP对1，3-DCP暴露的R2C细胞凋亡具有显著的抑制作用。
[0016]总之，C3G对1，3-DCP暴露的R2C细胞活性下降、细胞凋亡及孕酮功能表达损伤等具有较好的营养干预保护作用。
[0017]本发明具有以下有益效果:
本发明的研究成果对于了解花色苷的功能及发挥生殖毒性干预功能的机制等方面有一定的意义。
[0018]花色苷不仅有保健功能，而且还对一些毒性物质对生物体的危害具有重要的预防治疗作用，对于花色苷对1，3- 二氯-2-丙醇毒性的干扰作用及其作用机制的探索和研究，能够对人类预防及治疗1，3-二氯-2-丙醇引起的雄性生殖疾病提供重要依据，研究意义重大。
【附图说明】
[0019]图1为本研究的技术路线图。
[0020]图2为各浓度C3G及1，3-DCP作用后的细胞活性率。
[0021]图3为各浓度C3G及1，3-DCP作用下R2C细胞的细胞活性率。
[0022]图4为各浓度C3G及1，3-DCP对细胞形态的影响(400 X )。
[0023]图5为各浓度C3G及1，3-DCP对细胞凋亡的影响。
[0024]图6为各浓度C3G及1，3-DCP作用下的细胞凋亡率。
[0025]图7为各浓度C3G及1，3-DCP刺激4h或24h后对R2C细胞孕酮合成的影响(纵坐标单位:ng/106细胞)。
[0026]图8为各浓度C3G及1，3-DCP刺激不同时间后对ROS的影响。
[0027]图9为C3G及1，3-DCP对R2C细胞MMP的影响。
[0028]图10为C3G及1，3-DCP对R2C细胞MMP的影响作用分析。
[0029]图11为C3G与1，3-DCP作用24h后孕酮合成途径关键蛋白表达水平。
[0030]图12为各浓度C3G及1，3-DCP作用24h对cAMP水平的影响。
【具体实施方式】
[0031]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0032]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0033]本研究研究技术路线如附图1所示。本研究预选用抗氧化能力较强的花色苷(矢车菊素-3-0-葡萄糖苷，C3G)为目标物，研究C3G对1，3-DCP暴露的R2C细胞损伤的可能解毒途径和机制。
[0034]本实验采用睾丸间质瘤细胞R2C作为实验模型，以实验探索的1，3-DCP对R2C细胞活性抑制作用较明显的浓度(IC50:2mmol/L)对细胞进行致毒造模，然后通过MTT法来筛选C3G的适宜浓度，采用荧光显微镜观察细胞形态及大小变化。进而通过研究R2C细胞孕酮合成能力、R0S、MMP和cAMP的水平变化等来探讨C3G对1，3-DCP毒性作用的干预作用及具体机制。最后通过Western blotting法来检测孕酮合成过程中3 β-HSD、StAR等的量。
[0035]另外，以下实施例中，所有检测所得结果都是用均数土标准差(x±s)进行表示，并用Graphpad Prism5软件对数据进行统计分析，*p < 0.05、**p < 0.01及< 0.001表示结果有统计学意义。
[0036]实施例1 MTT法筛选1，3-DCP对R2C细胞作用浓度以及C3G干预浓度 1、MTT法筛选1，3-DCP对R2C细胞的作用浓度
Cl)实验方法
1)细胞培养至对数期，用胰酶消化，1500r/min转速下离心5min，将沉淀稀释为4X14个/mL，铺于96孔板，每个孔内约加200 μ L悬液；
2)24h后，在相应各组中分别加入不同浓度的1，3-DCP，各组浓度分别为1、2、4、6、8mmol/L，每组5个重复孔，每组重复3次，并设置无细胞的空白组；
3)24h后吸去液体，每孔加10 μ L 5mg/mL的MTT试剂，放于37°C培养箱；
4)MTT作用4h后，去除孔内液体，换成200 μ L的DMSO试剂，将96孔板置于摇床摇匀1min,酶标仪在570nm波长下检测各组的吸