速下降，且和1，3-DCP组比，结果有统计学意义(*P < 0.05，** P <0.01，*** P < 0.0ODo加药4 h后检测ROS结果表明，随着时间延长，1，3-DCP使ROS水平降低程度增大，各浓度C3G及1，3-DCP组的ROS水平与立即检测时相比升高，但仍然显著低于对应的1，3-DCP组，结果具有统计学意义(*P < 0.05)。采用1，3-DCP单独作用于R2C细胞及I, 3-DCP与20 ymol/L的C3G共同作用于R2C细胞对细胞内的ROS水平进行时间连续性检测结果表明，在2h内随着时间的延长，1，3-DCP使细胞内ROS水平逐渐升高，而在C3G的干预作用下，ROS水平与1，3-DCP单独作用时相比显著降低。
[0058]实施例7 FCM检测C3G对1，3-DCP造成R2C细胞MMP变化的影响 1、实验方法
(1)细胞培养、接种将对数期细胞接种于6孔板内，每孔接种ImL(约2万细胞)；
(2)加药24h后，加F12稀释的C3G溶液及1，3-DCP溶液，除第一组外，使每组每孔所加的 C3G 分别为 5、10、20、40 μ mo 1/L，每组每孔的 I, 3-DCP 浓度 2mmol/L ；
(为3)加药刺激4h后，400Xg转速5min，取IX 16细胞，重悬于0.5mL培养基中；
(4)JC-1工作液，按照说明书方法，配一定体积的工作液，完成后剧烈震荡至充分溶解；
(5)在每管中加0.5mL的JC-1染色工作液，混合完全后在37°C静置20min ;
(6)配制染色缓冲液(IX)，将染色缓冲液(5X )按照1:4的比例与超纯水混合，放在冰盒中；
(7)结束后，4°C、600Xg转速离心5 min，去掉上层液体；
(8)以400μ L的缓冲液(I X )吹打均匀细胞沉淀，用流式细胞仪测定各组的ΜΜΡ。
[0059]2、利用流式细胞仪检测R2C细胞线粒体膜电位损伤情况。各浓度C3G及2 mmol/L的1，3-DCP作用于细胞4h的MMP损伤检测结果如附图9和10所示，I, 3-DCP作用后的MMP损伤比率显著升高，与1，3-DCP组相比，各浓度C3G干预作用下的细胞MMP损伤比率均降低。其中，当C3G浓度为10、20、40ymol/L时结果有显著性差异。
[0060]实施例8 Western blotting测定C3G对1，3-DCP引起的R2C细胞孕酮合成关键调节基因StAR、3i3-HSD蛋白表达变化的影响
1、细胞总蛋白的提取
(1)R2C细胞培养、接种将对数期细胞接种于6孔板内，每孔接种ImL (约2万细胞)；
(2)加药培养24h，加F12稀释的C3G溶液及1，3-DCP溶液，除第一组外，使每组每孔所加的C3G分别为5、10、20、40 μ mo 1/L，每组每孔的I, 3-DCP浓度为2mmol/L ；
(3)24h后，400Xg离心5分钟后，弃去上层液体；
(4)在每组中先加入30?40μ L的裂解液(RIPA及PMSF以100:1的比例混合)，振荡裂解15s后，在冰上冷却45s，如此循环重复裂解2h，直至细胞充分裂解；
(5)211后，4°(:，10，000\8离心15min，然后将上清液转移至1.5mL EP管中，保存于_80°C冰箱。
[0061]2、蛋白浓度测定
(1)配制BCA工作液，按照说明书将A、B混匀，震荡；
(2)取7个0.2mL的PCR管编号I?7，2?7号管中均加入5 μ L的超纯水；
(3)取2mg/mL标准品1yL加到管I内，然后再取出5 yL到管2内，按照以上方法进行依次类推，配制2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL的稀释溶液；
(4)在96孔板内每孔加2μ L各个不同浓度的标准品及样品(每组样品加3个复孔)；
(5)所有孔加200μ L上述工作液，37°C静置半小时；
(6)酶标仪测定，依照标准曲线算出各孔浓度，将样品保存于-80°C冰箱。
[0062]3、蛋白样品处理
(1)根据所要测定的蛋白样品的浓度计算出每20μ g蛋白所需体积，并按照比例将各组蛋白样品与5X loading buffer (最终稀释成I X )混合；
(2)将样品在90?100°C水中煮10min ；
(3)于>8000g转速下离心10 min。
[0063]4、上述处理后的蛋白样品用于SDS蛋白电泳、转膜、封闭后，进行免疫杂交。免疫杂交的方法如下:
(1)将特定的一抗用一抗稀释液稀释至一定的浓度(稀释比例为1:1500)，在4°C条件下，摇床上孵育一夜；
(2)吸出一抗稀释液，把盒放于摇床，用TBST洗脱一抗，洗五次，7min/次；
(3)用脱脂牛奶将二抗稀释至一定浓度(稀释比为1:2500?1:5000)，孵育Ih ;
(4)吸出二抗液，并将盒放于摇床上，TBST洗脱二抗，一次洗lOmin，共洗5次；
(5)进行显影，显影结束后，将胶片取出放在室温下自然晾干，最后用扫描仪对其进行扫描处理。用Image J软件分析所得出的结果。
[0064]5、Western blotting结果表明，经过1，3-DCP刺激24h后，R2C细胞内与孕酮合成相关的蛋白(StAR、3 β -HSD)表达量与对照组均显著减少，而各浓度的C3G及1，3-DCP组与1，3-DCP组相比较，StAR蛋白表达量增加，3 β-HSD的量同样明显增加，且在C3G为20及40 ymol/L时，结果具有统计学意义(如图11所示)。
[0065]实施例9 CL检测C3G及1，3_DCP对R2C的cAMP水平影响
1、试剂准备:
(1)4.0 μ M cAMP溶液的制备:将250 μ L的诱导缓冲液与1.0 μ L的ImM cAMP混合；
(2)将Kinase-Glo缓冲液倒入棕色瓶子中混合，保存在_20°C冰箱；
2、细胞的诱导
(O将细胞进行消化、重悬，调整其浓度，按照IX 14/孔的浓度铺于96孔板进行培养;
(2)24h后，各组的孔中分别换上浓度为2mmol/L的1，3-DCP及5、10、20、40 ymol/LC3G的细胞培养液；
(3)加药刺激24h后，在每孔中加入20μ L的I X induct1n buffer。
[0066]3、制作cAMP标准曲线
(1)在96孔板上对A2?A12列的进行分组，每组3个复孔，分组后在各组的孔中均加入100 μ L的诱导缓冲液；
(2)在Al组的各个孔中加入200μ L的浓度为4.0 μ mmol/L cAMP溶液；
(3)从Al?11组，进行一系列的cAMP溶液的两倍稀释(注:A12组的各孔中不加cAMP溶液)；
(4)将各个浓度梯度cAMP标准液依次转移20μ L到预留的各孔内，制作cAMP标准曲线。
[0067]4、cAMP_Glo 检测步骤
(1)所有孔中加20μ LcAMP-G1裂解液，静放15min;
(2)cAMP检测液的制备:将 2.5 μ L 的 Protein Kinase A 液加入到 1.0mL 的 cAMP-Glo反应液中，充分混匀(现配现用)；
(3)在各组所有孔内均加40μ L的CAMP-Glo检测液，孵育20 min ；
(4)在所有的孔中加入80yL的Kinase-Glo试剂，摇动平板Imin混匀，置于室温1min ；
(5)荧光酶标仪测结果，用Graphpad软件统计分析所得结果。
[0068]5、CL检测试剂盒检测cAMP水平结果如附图12所示，在各浓度(5、10、20,40ymol/L)C3G及2 mmol/L I, 3-DCP刺激细胞4h后，各组细胞cAMP水平变化不明显。24h结果表明，1，3-DCP组的细胞cAMP水平明显下降，而C3G (20 ymol/L)对1，3-DCP引起的上述变化起到了显著的抑制作用，结果具有统计学意义(P < 0.05)。
【主权项】
1.矢车菊素-3-0-葡萄糖苷在制备预防和/或治疗1，3-二氯-2-丙醇引起的生殖疾病的药物中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述生殖疾病是指雄性生殖疾病。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述生殖疾病是指1，3-二氯-2-丙醇对生殖细胞的生殖毒性。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述生殖细胞为雄性生殖细胞。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述雄性生殖细胞R2C细胞。6.矢车菊素-3-0-葡萄糖苷在制备预防和/或治疗1，3-二氯-2-丙醇所引起的生殖细胞损伤和/或生殖细胞凋亡药物中的应用。7.矢车菊素-3-0-葡萄糖苷在制备抑制1，3-二氯-2-丙醇所引起的生殖细胞孕酮分泌量减少的药物中的应用。8.矢车菊素-3-0-匍萄糖苷在制备抑制1，3-二氯-2_丙醇所引起的生殖细胞ROS升高、MMP损伤和/或cAMP水平降低的药物中的应用。9.根据权利要求6?8任一所述应用，其特征在于，所述生殖细胞为R2C细胞。
【专利摘要】本发明公开了矢车菊素-3-O-葡萄糖苷在制备预防和/或治疗1,3-二氯-2-丙醇引起的雄性生殖疾病的药物中的应用。本发明研究结果显示，C3G对1,3-DCP暴露的R2C细胞活性下降、细胞形态损伤及细胞凋亡率升高等具有显著的抑制作用，而且C3G通过促进StAR、3β-HSD等关键蛋白的表达干预1,3-DCP暴露的R2C细胞孕酮合成，同时，C3G还通过降低1,3-DCP暴露的R2C细胞内ROS，进一步抑制MMP等，干预1,3-DCP造成的R2C细胞凋亡及孕酮表达功能损伤。本发明的研究成果能够对人类预防及治疗1,3-二氯-2-丙醇引起的雄性生殖疾病提供重要依据，研究意义重大。
【IPC分类】A61P39/02, A61K31/7048
【公开号】CN105079017
【申请号】CN201510411125
【发明人】白卫滨, 孙建霞, 胡云峰, 焦睿, 黄亚东
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年7月14日