水杨酸在制备抑制木糖葡萄球菌生物被膜药物中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水杨酸新医药用途，尤其涉及水杨酸在制备抑制木糖葡萄球菌或干预 木糖葡萄球菌生物被膜的药物中的应用，属于水杨酸新医药用途领域。
【背景技术】
[0002] 木糖葡萄球菌是一种血浆凝固酶阴性葡萄球菌（CNS)。此菌广泛分布于自然界， 以往认为是非致病菌。近几年，血浆凝固酶阴性葡萄球菌被认为是形成奶牛乳房炎的新兴 病原菌。奶牛乳房炎是对奶业危害十分严重的疾病之一，也是导致奶牛淘汰的第三大疾 病。引起奶牛乳房炎不易治愈和反复发作的最有说服力的说法就是其有很强的生物被膜 (Biofilm，BF)形成能力。生物被膜是细菌产生的多聚复合物基质将自身包绕，黏附于无 活性物体或活体表面，形成的有一定结构的细菌群体；它可以抵抗宿主免疫力和抗生素抑 菌杀菌作用；生物被膜内细菌容易对抗生素产生广泛的耐药性，造成感染难以治愈，反复发 作。
[0003] 生物被膜状态的细菌与浮游态的细菌在组成结构、生理特性、耐药性等方面差异 较大，生物被膜状态的细菌对抗生素及宿主的免疫反应是不敏感的，生物被膜状态的细菌 对抗菌剂的耐药性是一个多因素过程，主要是生物被膜中细菌与其浮游态在生理性上有所 不同。生物被膜形成后细菌可表达出独特的、不同于浮游菌的生物被膜表型，表达独特的 抗性基因。由于细菌生物被膜的耐药机制完全不同于浮游菌，能够抑制浮游态的细菌的抗 菌药物不一定能够干预或抑制细菌生物被膜；临床上发现即使反复试验证明有效的药物， 但也不能清除生物被膜，导致感染迀延不愈，浪费了大量的人力及物力，形成了公共卫生问 题。
[0004] 水杨酸是植物柳树皮提取物，是一种天然的消炎药。水杨酸能够抑制表皮葡萄球 菌，金黄色葡萄球菌等细菌生物被膜的形成，减小它们的毒性和黏附性。并且通过与高分子 聚合物结合控制水杨酸的释放度可以很好的抑制生物被膜的形成。水杨酸也可以抑制群体 感应系统。迄今为止，未见水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜具有干预或抑制作用的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供水杨酸在制备抑制木糖葡萄球菌或干预木糖葡 萄球菌生物被膜药物上的新用途。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
[0007] 本发明通过体外建立木糖葡萄球菌生物被膜，通过结晶紫法、XTT法和激光共聚焦 显微镜考察水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用。
[0008] 通过结晶紫法研究了不同药物浓度下水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作 用，结果表明各个浓度药物的OD值随着药物浓度的增大而减小，呈现负相关。每个浓度的 OD值与空白对照存在显著性差异。甲醇对照组和菌液对照组的OD值之间，没有显著性差 异，说明水杨酸对木糖葡萄球菌的生物被膜有确切的干预作用。
[0009] 通过XTT法和激光共聚焦显微镜观察了不同药物浓度下水杨酸对木糖葡萄球菌 的细菌活性的影响：XTT法结果表明随着水杨酸药物浓度的加大，抑菌率不断变大，当浓度 达到1/2MIC时，水杨酸对生物被膜里的活菌有很好的抑制杀灭作用；通过激光共聚焦显微 镜观察，在没有加药的情况下生物被膜形成较厚。而当水杨酸药物浓度达到1/2MIC时，生 物被膜明显变薄，细菌活力呈下降趋势，说明在水杨酸药物的作用下，药物可以渗透生物被 膜作用到内部，生物被膜内的木糖葡萄球菌明显受到抑制。
[0010] 综上所述，水杨酸对木糖葡萄球菌有杀菌作用并且对生物被膜有很好的干预或抑 制作用。因此，水杨酸可以用于制备抑制木糖葡萄球菌的药物。
[0011] 本发明公开了一种抑制木糖葡萄球菌的药物组合物，包括：预防或治疗上有效量 的水杨酸和药学上可接受的辅料或载体。
[0012] 本发明还公开了一种抑制木糖葡萄球菌生物被膜的药物组合物，包括：预防或治 疗上有效量的水杨酸和药学上可接受的辅料或载体。
[0013] 所述的抑制木糖葡萄球菌生物被膜包括干预木糖葡萄球菌生物被膜的形成或抑 制成熟的木糖葡萄球菌生物被膜的木糖葡萄球菌。
[0014] 所述的载体或辅料是指药学领域常规的载体或辅料，例如：稀释剂、崩裂剂、润滑 剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂、表面活性剂等；另外，还可以在组合物中加入其它辅助 剂如香味剂和甜味剂。
[0015] 所述稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分；常用的稀释剂包括乳 糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等。其中最常用为乳糖、淀 粉、微晶纤维素。
[0016] 所述崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮（与总重量比为2 - 6% )，交联羧甲基纤 维素钠（与总重量比为2 - 6% )、海藻酸（与总重量比为2 - 5% )、微晶纤维素（与总重 量比为5 - 15% )中之一种或几种混合物。其中以交联聚乙烯吡咯烷酮（与总重量比为 2 - 7%)，交联羧甲基纤维素钠（与总重量比为2 - 6%)为佳。最佳为交联聚乙烯吡咯 烷酮（与总重量比为2 - 6%)。
[0017] 所述的润滑剂包括硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸钙，聚乙二醇，滑石粉，氢 化植物油中之一种或几种混合物。其中以硬脂酸镁最为适宜。润滑剂的用量范围（与总重 量比）为0.10 - 1%，一般用量为0.25 - 0.75%，最佳用量为0.5 - 0.7%。
[0018] 所述的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分。可以是淀粉浆（10 - 30%， 与粘合剂总重量比），羟丙基甲基纤维素（2-5%，与粘合剂总重量比），聚乙烯吡咯烷酮 (2-20%，与粘合剂总重量比），以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳，最佳为聚乙烯吡咯烷 酮的50 %乙醇水溶液。
[0019] 所述助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种混合物。
[0020] 所述表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加药物溶出的成分。常用 为十二烷基硫酸钠（常用范围为0. 2 - 6%，与总重量比）。
[0021 ] 水杨酸，别名为：2-羟基苯甲酸、柳酸、邻羟基苯甲酸、升华水杨酸、邻-羟基苯甲 酸，植物柳树皮提取物，是一种天然的消炎药。其分子式为C7H6O3，分子量为138. 12,分子结 构⑴如下：
[0022]
[0023] 本发明技术方案与现有技术相比有以下有益效果：
[0024] 本发明水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜具有显著的抑制作用，能有效的干预木糖 葡萄球菌生物被膜的形成并杀灭成熟生物被膜内的木糖葡萄球菌，能应用于制备抑制木糖 葡萄球菌或干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的药物。
【附图说明】
[0025] 图1为不同药物浓度下水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用。
[0026] 图2为不同药物浓度下水杨酸对木糖葡萄球菌的抑菌率。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成限制。本领域技 术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形 式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0028] 1、材料
[0029] I. 1实验菌株
[0030] 木糖葡萄球菌ATCC700404购自美国标准菌种收藏中心。
[0031] 1.2 试剂
[0032] 生理盐水购于哈尔滨三联药业有限公司
[0033] 甲醇购于天津市科密欧化学试剂有限公司
[0034] TSB培养基购于青岛高科园海博生物技术有限公司
[0035] XTT试剂盒购于凯基生物科技发展有限公司
[0036]Live/dead试剂盒购于MolecularProbes
[0037]I. 3主要试剂的配制
[0038] TSB液体培养基：称取4. 5g培养基，加入200毫升蒸馏水，高压蒸汽灭菌。
[0039] 99%甲醇溶液：1ml水加入99ml100%的甲醇，混匀。
[0040] 0. 1 %结晶紫溶液：称取结晶紫0.lg，加入100mL蒸馏水，混匀。
[0041] 33%冰醋酸溶液：量取33ml的冰醋酸，加入67ml的蒸馏水，混匀。
[0042] L4实验仪器
[0043] 高压灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）
[0044] DH6000A电热恒温培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）
[0045] 超净工作台（上海力申科学仪器有限公司）
[0046]XK96-A快速混匀器（江苏新康医疗器械有限公司）
[0047] 96孔板（美国Corning公司）
[0048] 6孔板（美国Corning公司）
[0049] 电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司TD2002A)
[0050] 酶标仪（美国Epoch公司）
[0051] 激光共聚焦扫描电镜（莱卡Laica公司）
[0052] 实验例1水杨酸对木糖葡萄球菌生物被膜的干预作用
[0053] 1、实验方法
[0054] I. 1药物的配制
[0055] 精密称取水杨酸I. 〇〇g，溶于IOmL甲醇中，配成浓