光值；
5)通过Graphpad软件分析各浓度的1，3-DCP对R2C细胞活性的影响(用于分析的各孔吸光值均应减去相应空白组的吸光值)，并通过分析比较来确定后续的造模实验中所采用的1，3-DCP浓度。
[0037](2)结果显示，在I?8 mmol/L的范围内选择1、2、4、6、8 mmol/L几个浓度的1，3-DCP作用于处于生长对数期的各组R2C细胞，作用24h后检测细胞活性结果表明，当1，3-DCP浓度从lmmol/L升高到8mmol/L时，与对照组相比细胞活性随1，3-DCP浓度增大而降低，且2mmol/L的1，3-DCP使细胞活性率下降48.7%。因此在后续的C3G干预作用研究实验中，采用2mmol/L浓度的1，3-DCP作用于R2C细胞对其进行造模。
[0038]2、MTT法筛选C3G干预浓度 Cl)实验方法
1)细胞培养及接种细胞培养至对数期，消化、离心后，将沉淀稀释为4X14个/mL，铺于96孔板，每个孔内约加200 μ L悬液；
2)96孔板接种细胞24h，于第一个板的相应组内加经F12培养液稀释的C3G溶液，除对照组外，使每组每孔C3G终浓度分别为1、5、10、20、50、100 μ mol/L ;在第二个96孔板中加入用F12培养液稀释的C3G溶液及1，3-DCP溶液，除对照组外，使每组每孔C3G终浓度分别为l、5、10、20、50、100ymol/L，且每组每孔的1，3-DCP浓度为2 mmol/L ;重复孔及空白组的设置同步骤(I) 2);
3)各浓度C3G及1，3-DCP作用24h以后，去除液体，换成10μ L的MTT试剂，放在37°C ；
4)MTT作用4h后去除孔内的液体，换成200 μ L的DMSO试剂，将孔板放在脱色摇床上摇匀1min左右，然后检测各组吸光值；
5)通过Graphpad软件分析C3G对R2C细胞活性的作用及对1，3-DCP的抑制情况(用于分析的各孔吸光值均应减去相应空白组的吸光值)，通过分析比较选择合适的C3G浓度梯度(5、10、20、40 ymol/L)用于后续实验。
[0039](2)结果如附图2所示。MTT结果表明，1，3-DCP作用后使细胞活性显著下降，对细胞活性的抑制率接近50% ;1?100 μ mol/L浓度的C3G对1，3-DCP所引起的细胞活性下降均起到了干预保护作用，使细胞活性上升。其中，10、20 μ mol/L浓度的C3G对1，3-DCP的干预作用显著，结果有统计学意义(*P < 0.05，** P < 0.01)。
[0040]实施例2 MTT法测定C3G在细胞活性方面对1，3-DCP的抑制作用
1、实验方法
(I)细胞培养及接种细胞培养至对数期，用胰酶消化，1500r/min转速下离心5min，将沉淀稀释为4X 14个/mL,铺于96孔板，每个孔内约加200 μ L悬液。
[0041](2)96孔板接种细胞24h后，在其中一个96孔板的相应组中分别加入用F12培养液稀释的C3G溶液(除对照组外)，使每组每孔C3G终浓度分别为5、10、20、40 ymol/L。另一个96孔板中加入F12培养液稀释的C3G溶液和1，3-DCP溶液，除对照组外，使其它组C3G分别为5、10、20、40ymol/L，每组每孔的1，3-DCP浓度为2 mmol/L。复孔及空白组的设置同实施例1中步骤I (2)。
[0042](3)各浓度C3G及1，3-DCP刺激R2C细胞24h后，吸去上清，换成10 μ L 5mg/mL的MTT试剂，放在37 °C。
[0043](4) MTT作用4h，各孔换成200 μ L DMSO,置于脱色摇床上摇匀lOmin，酶标仪测定吸光值。
[0044](5)通过Graphpad软件分析各浓度组C3G对1，3-DCP的干预作用程度(用于分析的各孔吸光值均应减去相应空白组的吸光值)。
[0045]2、采用根据上述实验所确定的浓度分别为5、10、20、40ymol/L的C3G作用于处于生长对数期的各组R2C细胞，待其作用24h，测定细胞活性。并采用浓度为5、10、20、40 μ mol/L的C3G及2mmol/L的1，3-DCP作用于R2C细胞24h，采用MTT法测定细胞活性。MTT检测结果如附图3所示，当C3G浓度为20,40 ymol/L时，能显著抑制I, 3-DCP所引起的R2C细胞活性下降，且结果有统计学意义(*P < 0.05，** P < 0.0Do
[0046]实施例3荧光显微镜检测C3G对1，3-DCP造成R2C细胞形态变化的干预作用
1、实验方法
(I)将对数期细胞处理重悬后，并稀释细胞，6孔板内每孔接种ImL (约2万细胞)。
[0047](2)24h后，加F12稀释的C3G溶液及1，3-DCP溶液，除第一组外，使每组每孔所加的C3G分别为5、10、20、40 ymol/L，每组每孔的1，3-DCP浓度为2mmol/L。
[0048](3)各浓度C3G及1，3-DCP刺激24h，用荧光显微镜查看细胞形态并拍照。
[0049]2、荧光显微镜观察细胞形态如附图4所示。结果表明，与对照组细胞相比，在2mmol/L的1，3_DCP作用下，R2C细胞形状明显变小且细胞数目减少，细胞由不规则的多边形变成椭圆状，细胞变亮且周围的丝状物质增多，表明细胞的贴壁能力减弱。在加入不同浓度的C3G进行干预后，对于1，3-DCP所造成的细胞形态、数目及贴壁能力等各方面影响产生了不同程度的抑制作用，尤其是当C3G浓度为20、40ymol/L时，C3G作用效果更显著。
[0050]实施例4流式细胞术检测C3G对1，3-DCP诱导的细胞凋亡的抑制作用
1、实验方法
(1)将对数期细胞处理重悬后，并稀释细胞，6孔板内每孔接种ImL(约2万细胞)；
(2)24h后，加F12稀释的C3G溶液及1，3-DCP溶液，除第一组外，使每组每孔所加的C3G 分别为 5、10、20、40 ymol/L，每组每孔的 I, 3-DCP 浓度为 2mmol/L ；
(3)24h后收集细胞，PBS重悬细胞，1000r/min离心5min，弃上清；
(4)加200 yL Binding Buffering，混勾，加 5 μ L Annexin V-FITC，室温孵育 1min(需避光);
(5)孵育完毕后，1000r/min离心5min，弃上清；
(6)加200μ L Binding Buffering重悬细胞，加5 μ L PI后，直接上机检测。
[0051]2、结果如附图5和6所示，I, 3-DCP刺激细胞24 h后，细胞凋亡率显著升高，而加入不同浓度C3G干预后细胞凋亡比率明显降低，且当C3G浓度为10、20、40 ymol/L时，对1，3-DCP的干预作用显著，统计结果具有统计学意义(#P<0.01，*#P< 0.001)。上述结果说明C3G能够降低1，3-DCP引起的凋亡现象，且干预效果与其剂量相关。
[0052]实施例5 RIA法检测C3G对1，3-DCP造成R2C细胞孕酮合成影响的干预作用
1、细胞上清收集(1)将培养至对数期的R2C细胞接种于6孔板内，每孔接种ImL(约2万细胞)；
(2)细胞培养24h后，分别换上含终浓度为2mmol/L浓度的1，3-DCP及5、10、20、40ymol/L C3G的培养液。
[0053](3)加药刺激4h或者24h收集细胞上清，在400Xg转速下离5 min，将上清液装到ImL Ep管，保存于-20 °C ；
(4)根据试剂盒说明书上的具体说明，检测事先所收集的各组细胞上清中的孕酮量:
1)孕酮标准品配制:用超纯水溶解标准品，使溶解后SO?S6的浓度依次为:0，0.2，1，3，10，30，100 ng/mL ；
2)质控样品配制:将各质控品分别加到已加0.5mL水的管内，并待15min后用；
3)加标准品、质控品、待测品各50μ L到5mL干净管中，随后在每管加入100 μ L 125IC5典 125)；
4)将兔抗孕酮抗体在上述每个管均加100μ L，4°C过夜；
5)将驴抗兔免疫分离剂在各管均加0.5mL，轻轻晃勾，静放15min，在3500 rpm/min转速下，离心15 min ；
6)去除除沉淀外的上层液体，用γ计数仪检测；
7)得出数据后，对各组孕酮含量结果进行统计分析。
[0054]2、检测结果如附图7所示，I, 3-DCP刺激细胞4h后，细胞孕酮分泌量降低，此时各组的孕酮合成量变化不大，C3G对1，3-DCP作用的干预效果不明显。24h结果与4h结果相比，I, 3-DCP使细胞孕酮分泌量显著降低，而C3G对1，3-DCP作用的干预作用也显著增强。其中，20、40 μ mol/L浓度的C3G使孕酮分泌量显著升高(*P < 0.05)。
[0055]实施例6荧光酶标仪测定C3G对1，3-DCP引起的ROS变化的影响作用
1、实验方法
(1)DCFH-DA溶液的配制:按照1:1000的比例将DCFH-DA用F12培养液进行稀释，使终浓度为10 μ mol/L;
(2)加药处理:24h后，加F12稀释的C3G溶液及1，3-DCP溶液，除第一组外，使每组每孔所加的C3G分别为5、10、20、40 ymol/L，每组每孔的I, 3-DCP浓度为2 mmol/L ；
(3)加药后立即或24h后，吸出上清液，加入ImLDCFH-DA稀释液(检测细胞内ROS水平连续变化情况时，加药后立即进行下一步操作，且每隔1min检测一次ROS水平)；
(4)37°C放置20min，然后用F12培养液洗3次，以充分除掉未被吸收利用的剩余DCFH-DA ；
(5)消化、离心、重悬细胞后，将细胞接种到96孔板，各个孔均加200μ L，设置4个复孔。荧光酶标仪检测最终ROS水平(激发波长:488nm，发射波长:525 nm)。
[0056]2、荧光酶标仪检测ROS水平结果如附图8所示。
[0057]加入各浓度C3G及1，3-DCP之后，立即检测ROS水平。结果表明，1，3-DCP组的ROS水平稍有上升，而加入各浓度C3G干预后，各组的ROS水平迅