反义microRNA-25及其应用
【专利摘要】本发明涉及反义microRNA?25、含有反义microRNA?25碱基序列的载体、含有反义microRNA?25的组合物，以及反义microRNA?25的组合物作为干预关键氧化应激相关因子表达的药物的应用。与现有技术相比，本发明提供的反义microRNA?25及其相应载体或组合物能够多靶点干预关键氧化应激相关因子表达，可用于抗氧化损伤、抗肿瘤、心衰、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病等氧化应激相关疾病治疗或预防药物中。
【专利说明】
反义microRNA-25及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种氧化应激相关分子，尤其是设及反义microRNA-25及其应用。
【背景技术】
[0002] 能够造成视力不可逆损伤的年龄相关性黄斑变性（Age Related Macular Degeneration, AMD)是一个复杂的多因性疾病，目前缺乏有效的针对病因的治疗措施。氧化 应激是AMD的主要发病机制之一，视网膜色素上皮(Retinal Pigment化ithelium，RPE)细 胞为其始发病变细胞。但是目前缺少对RPE细胞氧化损伤作用机制的研究。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的就是为了提供反义microRNA-25及其应用。
[0004] 本发明在探究microRNA-25在RPE细胞的氧化损伤中的作用及机制的时候，发现W 氯化钻(CoCb)和糖氧剥夺模型（0巧gen Glucose Deprivation，0GD)两种手段模拟体外缺 氧/氧化应激条件，分别研究两种形式的氧化损伤对原代RPE细胞和人RPE细胞系的 microRNA-25表达的影响，在体外水平，明确氧化损伤对microRNA-25在R阳细胞中的诱导效 应。W小鼠氧诱导的视网膜病变(Oxygen Induced Retinopathy，0IR)为体内缺氧/氧化应 激模型，通过qRT-PCR方法检测神经视网膜W及RPE/脉络膜复合体的microRNA-25在常氧组 和缺氧组的表达差异，通过体内实验进一步证实缺氧/氧化应激对microRNA-25的诱导效 应。通过双巧光素酶报告实验验证与祀基因的体外相互作用，通过功能获得和缺失实验了 解microRNA-25对下游祀基因的调控作用，通过人血管内皮的成管实验和R阳细胞的吞隧实 验，探究microRNA-25在缺氧/氧化应激诱导的异常血管发生和R阳细胞吞隧功能损害中的 影响，并通过对0IR小鼠模型的实验性治疗来进一步探究microRNA-25在氧化损伤中的作 用。通过W上研究明确microRNA-25在WE细胞氧化损伤中的作用和机制，分析其在AMD的 发生发展中的功能。
[0005] 基于W上研究，本发明提供一种反义microRNA-25，其为microRNA-25的反义RNA， 其碱基序列如沈9 10^.1所示，1111沈〇1?^4-25的序列如沈9 10^.2所示。
[0006] 该反义microRNA-25可W采用人工合成的方法得到，该合成方法为常规技术手段。
[0007] 本发明第二方面提供所述反义mic;roRNA-25在制备抑制mic;roRNA-25上调的药物 中的应用。
[000引本发明第Ξ方面提供含有所述反义microRNA-25碱基序列的载体。
[0009] 本发明第四方面提供含有所述反义microRNA-25的组合物。
[0010] 本发明第五方面提供含有所述反义microRNA-25的组合物作为干预关键氧化应激 相关因子表达的药物的应用。具体而言，含有反义microRNA-25的组合物用于制备预防和/ 或治疗抗氧化损伤、抗肿瘤、屯、衰、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病的药物。
[0011 ] 基于上述研究，可知反义mic;roRNA-25可W抑制mic;roRNA-25上调，而mic;roRNA-25 上调主要体现在氧化应激的条件下，因此，反义mic;roRNA-25或含有反义mic;roRNA-25序列 的载体或含有反义microRNA-25的组合物可W作为干预关键氧化应激相关因子表达的药物 使用，主要应用于治疗抗氧化损伤、抗肿瘤、屯、衰、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病等 疾病的预防和/或治疗药物。
[0012]与现有技术相比，本发明提供的反义mic;roRNA-25及其相应载体或组合物能够多 祀点干预关键氧化应激相关因子表达，可用于抗氧化损伤、抗肿瘤、屯、衰、年龄相关性黄斑 变性、糖尿病视网膜病等氧化应激相关疾病治疗或预防药物中。
【附图说明】
[OOU] 图1为RPE细胞氧化应激与microRNA-25表达结果示意图；
[0014] 图2为0IR小鼠模型中，microRNA-25在神经视网膜和RPE/脉络膜复合体中的表达 结果示意图；
[0015] 图3为0IR小鼠模型中，PEDF和VEGF在RPE/脉络膜复合体中的表达结果示意图；
[0016] 图4为在阳DF的3'UTR区miR-25的祀向序列在几个物种中高度保守示意图；
[0017] 图5为巧光素酶报告实验验证PEDF和ITGAV均为miR-25的可能祀基因；
[001引图6为RPE细胞过表达miR-25后，阳DF和ITGAV的表达量变化示意图；
[0019] 图7为反义miR-25预处理对0GD引起的ITGAV和阳DF改变的影响的示意图；
[0020] 图8为反义miR-25预处理对0GD引起的吞隧抑制的影响示意图；
[0021] 图9为反义miR-25预处理对0GD引起的成管能力增加的影响示意图；
[0022] 图10为反义miR-25预处理对0IR模型中的新生血管渗漏增加的影响示意图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0024] 实施例1
[00 巧]一种反义 microRNA-25,其为 microRNA-25 的反义 RNA，其为 microRNA-25 的反义 1?^八，其碱基序列如沈9 10^.1所示，1111沈〇1?^4-25的序列如沈9 10^.2所示。
[0026] 该反义microRNA-25可W采用人工合成的方法得到，该合成方法为常规技术手段。
[0027] 实施例2
[00巧]本实施例W氯化钻（CoCb)和糖氧剥夺模型（0巧genGlucoseD邱1'；[￥日1:;[0]1，060)两 种手段模拟体外缺氧/氧化应激条件，分别研究两种形式的氧化损伤对原代WE细胞和人 R阳细胞系的microRNA-25表达的影响。
[0029] 原代RPE细胞糖氧剥夺12,16,18,20小时，复氧2小时，通过qRT-PCR检测miR-25的 表达，发现随糖氧时间剥夺的延长，miR-25表达增加。
[0030] 原代R阳细胞W不同浓度的氯化钻溶液处理12小时后，通过qRT-PCR检测miR-25的 表达，发现随着处理浓度的增加，miR-25表达上调。
[0031] 原代R阳细胞Κ200μΜ的氯化钻溶液处理不同时间，通过qRT-PCR检测miR-25的表 达，发现随着处理时间的延长，miR-25表达上调。
[0032] 两种形式的缺氧/氧化应激(CoCb和0GD)均能诱导原代RPE细胞中的microRNA-25 上调。但人R阳细胞中的microRNA-25只能被0GD模型诱导(结果未列出），可能是细胞系与原 代细胞的差异或者是C0CI2和0GD的差异。
[0033] 如图1所示，在R阳细胞氧化应激能够增加 mic;roRNA-25表达。（图ΙΑ的横坐标表示 糖氧剥夺的时间，纵坐标表示miR-25在RPE细胞中的相对表达量;图1Β的横坐标表示不同浓 度的氯化钻溶液，ctr表示未处理组即正常对照组，纵坐标表示miR-25在WE细胞中的相对 表达量；图1C的横坐标表示200μΜ的氯化钻溶液处理不同时间，纵坐标表示miR-25在RPE细 胞中的相对表达量）
[0034] 实施例3
[0035] W小鼠氧诱导的视网膜病变(0巧genInducedRetinopathy，0IR)为体内缺氧/氧化 应激模型，通过qRT-PCR方法检测神经视网膜W及RPE/脉络膜复合体的microRNA-25在常氧 组和缺氧组的表达差异，通过体内实验进一步证实缺氧/氧化应激对microRNA-25的诱导效 应。
[0036] 0IR小鼠模型的构建方法：
[0037] 将模型组小鼠于生后第7d时，随同2只哺乳母鼠放置到连接测氧仪的动物实验舱 中，.化/min的流量通入氧气他），使氧浓度稳定控制在75% ±2%。日光照明。每天定时 规律地打开氧舱清扫、换敷料(保持干燥）、换食加水，并将在正常环境的哺乳母鼠与舱内母 鼠更替。至小鼠生后第12加寸将模型组小鼠及其哺乳母鼠返回正常空气环境(21%化）中，W 诱导小鼠视网膜新生血管产生。正常组小鼠始终放置在正常空气中喂养。
[0038] qRT-PCR 方法：
[0039] 1.总 RNA 抽提：
[0040] 视网膜或脉络膜组织用匀浆仪进行匀浆处理后加入TRIzol，单层培养细胞直接在 培养皿中加入TRIzol，用移液器吸打几次。
[0041 ] 每使用ImURIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室溫放置3分钟。
[0042] 4°C 10000 Xg 离屯、15 分钟。
[0043] 把水相转移到新管中，用同体积异丙醇沉淀RNA，室溫放置10分钟。
[0044] 4°C10000Xg离屯、10分钟，离屯、前看不出RNA沉淀，离屯、后在管侧和管底出现胶状 沉淀。移去上清。
[0045] 用75 %乙醇洗涂RNA沉淀。每使用ImlTRIzol至少加lml75 %乙醇。4°C不超过7500 X g离屯、5分钟，弃上清。惊5-10分钟，加DEPC水充分溶解后nano化op测浓度。
[0046] 2.具体逆转录方法参考？1'；[111日-5沈1911?化日日旨日]11:1(;[1:(061104.1'日4日^)说明书。简 述如下：首先配置A，B两个混合物，A混合物终体积为化1，不足时用DEPC水不足，过量时，减 少RNA用量，然后A混合物70°C lOmin，置于冰上2-3min，加入化1B混合物，混匀，然后放入PCR 仪，程序设定为30°C lOmin，42°C Ihr，70°C 15min，4°C，随机9具体引物可商品化购得，miR-25 的特异性逆转录茎环引物由本实验室自行设计。
[0047] A混合物中，总RNA0.化g，1(Μ随机引物2.化1，SiiM茎环引物化1。
[004引 B混合物中，5Xbuffer 2μ1，10πιΜ dNTP 0.5yl，RTase 0.化1。
[0049] 3.实时巧光定量PCR
[0050] 用SYBN-GREEN相对定量法，miRNA逆转录产物Wu6作为内参基因，扩增普通的基因 (即非miRNA)时，使用通用引物的逆转录产物，扩增miRNA及其内参基因时，使用由茎环引物 和随机引物同时逆转录出来的产物，二者的反应体系略有不同，反应程序一致，具体如下： [0化1] miRNA逆转录产物的qPCR:
[0052] 扩增miRNA的反应体系：
[0053] 2Χπ?χ10μ1 [0化4] ΙΟμΜ上游引物化1
[0化5] ΙΟμΜ下游引物1.化1
[0056] dd肥03.6μ1
[0057] cDNA 化 1
[005引扩增u6的反应体系，同扩增其它非miRNA基因一样。
[0059] 目的基因相对表达量的计算，与扩增其它基因一样，采用2AET，或2AAET法，只与内 参基因比较，最后获得相对内参基因的表达量的方法为2AET，而如果与内参基因比较后，再 同对照组比较，最后获得的是相对于对照组的相对表达量的方法为法。
[0060] 图2所示，在0IR小鼠模型，不论是RPE/脉络膜复合体还是神经视网膜，缺氧组 microRNA-25的表达都显著高于常氧组，更进一步证实缺氧/氧化应激对microRNA-25的诱 导效应。图2为qRT-PCR检测0IR模型小鼠，不同时间microRNA-25在视网膜(左侧图）的表达， W及在RPE/脉络膜复合体(右侧图）的表达，每组数据都表达为均数±标准误差，*表示p< 0.05，**表示pCO.Ol，NS表示无显著差异。（图2中，横坐标:采样时间点；纵坐标:miR-25在 RPE/脉络膜复合体中的相对表达量:pdl2:出生后12天;pdl5:出生后15天;pdl7:出生后17 天;pd21:出生后21天;黑色柱形图：0IR(氧诱导的视网膜病变模型组）；白色柱形图：CTR(正 常对照组）。
[0061] 但是如图3所示，色素上皮衍生因子（PEDF)下降，血管内皮生长因子（英文： vascularendothe 1 ialgrowthfactor，简称：VEGF)。图3为qRT-PCR检测0IR模型小鼠，不同时 间PEDF在视网膜(左侧图）的表达，W及VEGF在视网膜(右侧图）的表达，每组数据都表达为 均数±标准误差，*表示P <0.05，**表示P <0.01，NS表示无显著差异。
[0062] 图3是通过qRT-PCR方法检测阳DF和VEGF在不同时间点，在正常对照组和0IR模型 组中小鼠的RPE/脉络膜复合体中的相对表达量。
[0063] 图3的左侧图中，横坐标:采样时间点；纵坐标:P抓F在RPE/脉络膜复合体中的相对 表达重:pdl2:出生后12天；pdl5:出生后15天;pdl7:出生后17天;pd21:出生后21天；黑色柱 形图：0IR(氧诱导的视网膜病变模型组）；白色柱形图：CTR(正常对照组）
[0064] 图3的右侧图中，横坐标:采样时间点;纵坐标:VEGF在RPE/脉络膜复合体中的相对 表达重:pdl2:出生后12天；pdl5:出生后15天;pdl7:出生后17天;pd21:出生后21天；黑色柱 形图：0IR(氧诱导的视网膜病变模型组）；白色柱形图：CTR(正常对照组）
[00化]microRNA-25能够同时祀向色素上皮衍生因子(P抓F)和口 GAVemicroRNA-25的种 子序列与口 GAV的祀序列有10个碱基完全互补因此能够在mRNA水平上抑制口 GAV，而PEDF的 3'UTR区只有6个碱基与microRNA-25种子序列互补（图4)，microRNA-25对阳DF的调控可能 更多的存在于蛋白水平。阳DF是microRNA-25的祀基因目前尚无文献报道。经过巧光素酶报 道分析，验证PEDF是mi croRNA-25的祀基因（图5)。在RPE细胞过表达能够引起阳DF和ITGAV 降低（图6)
[0066] 双巧光素酶报告实验的具体步骤：
[0067] 1.3'UTR报告质粒的构建
[006引首先设计大鼠阳DF的3 ' UTR引物，然后提取大鼠组织RNA，逆转录后PCR扩增:RNA提 取和逆转录方法同前。将回收的DNA产物及psiC肥CK-2各自用Notl，xohl双酶切，体系如下： Notl，xohl各化1，10 XH缓冲液化1，0.1 %BSA2yl，0.1 %Triton-100化1，DNA《化 1，其余用 d地20补足。2. SygpsiC肥CK-2质粒，酶切提示同DAN产物的酶切体系，酶切37°C，3小时，酶 切结束后过柱纯化。酶切后的DNA片段和psiC皿CK-2连接，体系如下：10 XT4连接酶缓冲液 2.5μ1，0ΝΑ片段和载体DNA片段的摩尔比例控制在3~10:1，1μ1Τ4连接酶，d地20补足。16°C 连接过夜。连接产物转化:取10化1感受态，加1化1连接产物，轻轻混匀后放置冰上30min，放 入42°C水浴中90s进行热休克，期间不要摇动试管;冰浴2min;向管中加入80化1的LB培养基 (不含抗菌素)轻轻混匀，37°C摇床(100-150r/min)，溫和震荡45min;将菌液离屯、，弃上清， 留10化1上清，加至含lOOug/mlAmp的LB平板培养皿中，用火焰灯烧过的玻璃涂布棒涂布均 匀。将其放置在37Γ恒溫培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置 过来放入37 °C恒溫培养箱过夜;次日挑单克隆，摇菌，测序。阳性克隆，保种后大提质粒
[0069] 2.双巧光素酶报告实验
[0070] 293T细胞铺24孔板，细胞长至70%汇合时，用脂质体119〇2000，共转染日旨〇-11111?-25 (miR-25激动剂)和psiC肥CK-P邸。-3'1]了1?，日邑〇-11111?-25的终浓度为10碰，口31(：肥0(斗邸尸-3' UTR终浓度为InM，设置4个复孔，同样ago-miR-25和psiC肥CK-ITGAV-3 ' UTR共转染，设置4个 复孔，WpsiC肥CK-2的空载体作为阴性对照。转染后6小时，吸出转染液，更换为完全培养基 (高糖DMEM，10%FBS)，48小时后，按双巧光素酶报告系统说明书操作，简介如下:每孔加100 μ11 X化B裂解液，室溫，溫和摇15分钟，收裂解液，离屯、收取上清。白色不透光的96孔酶标板 中每孔加刚刚裂解的上清液10化，加入1(Κ)化预先混好的LARII，2s后测数据。每孔添加10化 化预先混好的Stop&Glo试剂，静止2s后，测数据。
[0071] 图4表示在PEDF的3'UTR区miR-25的祀向序列（加亮区）在几个物种中高度保守。 mmu:小家鼠，:rno:大鼠，C化:家犬，cpo:豚鼠
[0072] 图5表示通过巧光素酶报告实验分析，P邸F(左侧图）和口GAW右侧图）是miR-25的 祀基因。左侧图横坐标表示实验分组:psiC肥CK-P抓F-3 'UTR表示转染插入了阳DF的3 ' UTR 序列的质粒组，psiC肥CK表示转染空载体的对照组。黑色柱状图表示共转染miR-25序列组， 白色柱状图表示共转染无关序列的阴性对照组。该结果提示与其它各组相比，只有同时转 染miR-25和psiC肥CK-P抓F-3'UTR的细胞的巧光素比值才会显著下降，提示二者存在相互 作用。纵坐标表示相对巧光素酶活性。
[0073] 右侧图横坐标表示实验分组:psiCHECK-ITGAV-3'UTR表示转染插入了 ITGAV的3' UTR序列的质粒组，psiCHECK表示转染空载体的对照组。黑色柱状图表示共转染miR-25序列 组，白色柱状图表示共转染无关序列的阴性对照组。该结果提示与其它各组相比，只有同时 转染miR-25和psiCHECK-ITGAV-3'UTR的细胞的巧光素比值才会显著下降，提示二者存在相 互作用。纵坐标表示相对巧光素酶活性。
[0074] 图6表明WE细胞过表达miR-25后，通过qRT-PCR方法检测，miR-25表达量明显上 调，阳DF和口GAV的表达量显著下降，提示miR-25能同时调节阳DF和口GAV的表达。图6横坐 标表示Ξ种基因(miR-25,阳DFJTGAV)，纵坐标表示Ξ种基因的相对表达量。
[0075] 在RPE细胞中抑制microRNA-25能够对抗0GD氧化损伤引起的PEDF分泌减少和 ITGAV表达下降（图7似及吞隧功能抑制（图8)。
[0076] 图7左侧图表示qRT-PCR检测抑制miR-25对0GD引起的ITGAV下调的影响。每组数据 都表达为均数±标准误;**表示和对照组相比P<〇. 01。横坐标表示Ξ个分组，第一组为正常 对照组(R阳细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，不给予OGD处理），第二组为OGD 处理组(WE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，给予OGD处理），第Ξ组为反义 miR-25预处理组(R阳细胞用反义miR-25转染预处理48小时后，给予OGD处理），纵坐标表示 ITGAV的相对表达量。
[0077]图7左侧图实验步骤：首先根据实验分组，对RPE细胞转染相应的序列，使用 (1 ifetechnology的1 ipo2000试剂），转染48小时候，施加0GD处理，然后提总RNA，通过qRT- PCR检测ITGAV的相对表达量。
[007引图7右侧图表示ELISA检测抑制miR-25对0GD引起的PEDF分泌减少的影响。每组数 据都表达为均数±标准误;**表示和对照组相比P<0. 01。横坐标表示Ξ个分组，第一组为正 常对照组(WE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，不给予0GD处理），第二组为 0GD处理组(R阳细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，给予0GD处理），第Ξ组为反 义miR-25预处理组(R阳细胞用反义miR-25转染预处理48小时后，给予0GD处理），纵坐标表 示PEDF的含量，单位为ng/mL。分别收集Ξ组细胞的转染阶段和0GD处理阶段的细胞培养基， 通过化ISA试剂盒检测培养液中PEDF的含量，通过实验发现，0GD引起的PEDF分泌减少能够 被反义miR-25预处理矫正。
[0079] 图8表示通过吞隧实验检测抑制miR-25对0GD引起的吞隧抑制的影响。标尺为25μ m，蓝色代表细胞核，紫色为紧密连接蛋白（Ζ0-1)，绿色表示WE细胞内吞的外节，黄色为结 合在R阳细胞膜上的外节。a图：RPE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，不给予 0GD处理;b: R阳细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，给予0GD处理;C: R阳细胞用 阴性对照的无关序列转染预处理48小时，给予0GD处理。本实验结果提示，0GD引起的WE细 胞内吞和结合的外节减少可W被反义miR-25预处理矫正。
[0080] 吞隧实验步骤：
[0081] 首先制备猪外节，然后用NHS-LC-LC-生物素标记猪外节，将其按一定浓度与完全 培养基混合，在0GD处理的复氧阶段，将原来的培养基更换为含有猪外节的培养基，解育3- 4小时，PBS洗3次，每次5分钟，然后用4 % PFA，室溫固定10分钟，然后PBS洗，充分去除残余的 PFA，用1 %BSAPBS溶液封闭10分钟，然后抗小鼠的化odopsin室溫解育半小时，PBS洗3次每 次15分钟，彻底清楚残留的化odopsin，然后解育抗兔的Z0-1，4°C过夜。次日，PBS洗3次，然 后用0.1%时1扣11乂-100?85溶液透膜5-10分钟，然后与〔￥5-抗兔，〔￥3-抗小鼠和。11'(：- AVIDIN-起室溫解育1小时。DAPI染核，然后封片，激光共聚焦显微镜拍照。内吞进R阳细胞 的外节发绿光，而结合在RPE细胞表面的外节由于结合了化odops in可W发红光，同时外节 标记的生物素又能与FITC-AVIDIN结合而发绿光。因此重叠图像显示，R阳细胞外的P0S为黄 色，而内吞进WE的P0S为绿色。R阳细胞的边缘，被Z0-1染出，带CY5巧光，人肉眼无法分辨， 但激光共聚焦显微镜可W分辨出来。运样根据外节的位置及其所显示的颜色也能判断是内 吞还是结合的外节。选择有代表性的视野，每个样本至少数50个细胞，计数总的吞隧外节数 (绿色），和结合的外节数(黄色），但是由于专利附图为黑白图，在图中显示不到绿色和黄 色，二者之差即为内吞的外节数。最后W每个细胞平均结合的外节数和内吞的外节数为指 标来衡量，不同组的吞隧功能的差异。
[0082] 0GD处理的R阳细胞，如果该组细胞未提前抑制microRNA-25,则其来源的条件培养 基6小时生成的血管数量明显多于microRNA-25抑制组。运一结果提示，缺氧/氧化应激引起 的促新生血管功能可能是mic;roRNA-25部分依赖的，由于mic;roRNA-25在缺氧/氧化应激中 上调，通过祀向，抑制阳DF，发挥促新生血管的作用。使用IMAGEJ软件计数每组至少5-6个视 野的血管分支数。
[0083] 图9A，通过成管实验检测抑制miR-25对0GD引起的促新生血管作用。a:条件培养基 来自第一组为正常对照组(RPE细胞用阴性对照的无关序列转染预处理48小时，不给予0GD 处理）；b:条件培养基来自第二组为0GD处理组(R阳细胞用阴性对照的无关序列转染预处理 48小时，给予0GD处理）；C:条件培养基来自第Ξ组为反义miR-25预处理组(WE细胞用反义 miR-25转染预处理48小时后，给予0GD处理）。X 10倍。
[0084] 图9B，生成血管的统计，该图横坐标表示用来自3个实验组条件培养基培养人视网 膜微血管内皮细胞，Ξ个实验组分别为第一组为正常对照组(R阳细胞用阴性对照的无关序 列转染预处理48小时，不给予0GD处理），第二组为0GD处理组(R阳细胞用阴性对照的无关序 列转染预处理48小时，给予0GD处理），第Ξ组为反义miR-25预处理组(WE细胞用反义miR- 25转染预处理48小时后，给予0GD处理）。收集Ξ组细胞的转染阶段和0GD处理阶段的细胞培 养基做为成管实验的条件培养基。纵坐标表示平均每个视野的血管分支数，值越大，代表成 管能力越强。本结果提示，只转染阴性无关序列，然后给予0GD处理RPE细胞后收集的条件培 养基具有较强的成管能力，但预先转染miR-25的反义序列，在给予0GD处理，该组条件培养 基的成管能力显著下降，可能与PEDF的分泌量恢复(图7右侧图）有关。
[0085] 图9成管实验具体方法：
[00化]1.人视网膜微血管内皮细胞巧umanRetinalMicrovascularEndothelialCells， HRMEC)的培养。该原代细胞购于Angio-Proteomie(ΜΑ，USA)，培养基为ECM，5%FBS，1 %P/S， 在铺细胞之前，培养皿要用1-化g/cm2的牛血浆纤连蛋白包被，37 °C解育2小时后，回收纤连 蛋白溶液，再用d地20冲洗一遍，然后即可铺细胞，包被好的培养皿不能储存留待W后用。回 收的纤连蛋白溶液，放于4°C保存，可重复用1-2次。
[0087] 2.ma化igel基质胶，4°C融化，按15化1/孔，均匀包被预冷过的48孔板，37°C放置1 小时后，备用。
[0088] 3. HRMEC膜酶消化，用完全培养基重悬，按2-3 X 10^孔的浓度铺板，细胞培养箱解 育1小时后，将完全培养基替换为条件培养基，每隔2小时观察一次，W便及时发现处理组和 对照组的差别。
[0089] 图10中上排的Ξ幅图表示通过视网膜铺片观察抑制miR-25对0IR引起的新生血 管渗漏的影响。a:常氧组+注射阴性对照病毒;b:0IR组+注射阴性对照病毒;c:0IR组+注射 lenti-anti-miR-25。X5倍。
[0090] 图10下排的两幅图表示利用閒0T0S册P3.0标记新生血管渗漏区。b: 0IR组+注射阴 性对照病毒；C:0IR组+注射lenti-anti-miR-25，X5倍。
[0091] 图10具体实验步骤：
[0092] 构建0IR小鼠模型，出生后12天时进行视网膜下腔注射lenti-anti-miR-25和阴性 对照病毒(可从公司购买也可W自己制备），左右眼自身对照；常氧注射阴性对照病毒。5天 后小鼠进行屯、脏灌注，做视网膜铺片。观察视网膜缺血，新生血管等情况。
[0093] 视网膜下腔注射：
[0094] 刚出氧舱的OIR小鼠 （pd 12)，立刻用1 % avert in (用0.9 %的生理盐水配置），按 O.lml/lOg的剂量腹腔注射麻醉，然后进行视网膜下腔注射浓缩的Lenti-anti-miR-25，W 及阴性对照Lenti-anti-ctr，各化1，左右眼自身对照。处理后的小鼠注意保溫，pdl2小鼠尚 未完全睁眼，所W需要小屯、剪开连着的眼险，注意避免出血，阻碍注射视野并伤害小鼠。 [00M]屯、脏灌注，视网膜铺片：
[0096] 首先将5%葡萄糖溶液和PBS缓冲液按4:1的体积比混合，并过滤，配置成细胞膜红 色巧光探针(D i 1)溶解液。
[0097] 按每100m曲i 1加16.7ml的100 %乙醇的比例，配置Di 1的储存液，避光室溫，溫和摇 床过夜。要灌注之前将Di 1的储存液用溶解液50倍稀释，配置成工作液。
[0098] 将小鼠用avertin麻醉，四肢固定，剪开胸腔，进行左屯、室灌注，先用PBS灌注，待物 血液流出时，灌注Dil工作液(每只小鼠5ml灌注液），然后再灌注4%PFA。灌注后，取下眼球， 可W泡在PBS中4°C存放，也可W马上在体视显微镜下，去除眼前节，小屯、取出视网膜，在载 玻片上剪成6瓣，然后用加抗巧灭的封片剂封片，拍照。一旦视网膜铺片完成，就要马上在巧 光显微镜下观察，不能4°C存放，防止染料泄露。
[0099] 一定程度的氧化损伤通过上调microRNA-25促进R阳细胞异常增殖，减少PEDF的分 泌，抑制RPE细胞的吞隧功能，从而促进了 AMD的发生和发展。祀向RPE的抗microRNA-25的干 预方法可能是个有效的针对病因的AMD治疗手段。祀向microRNA-25也是治疗异常新生血管 的一个策略。
[0100] 上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。 熟悉本领域技术的人员显然可W容易地对运些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般 原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领 域技术人员根据本发明的掲示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的 保护范围之内。
[0101：
【主权项】
1. 一种反义microRNA-25，其特征在于，为microRNA-25的反义RNA，其碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 一种如权利要求1所述的反义microRNA-25在制备抑制microRNA-25上调的药物中的 应用。3. -种含有权利要求1所述的反义microRNA-25碱基序列的载体。4. 一种含有权利要求1所述的反义microRNA-25的组合物。5. -种含有权利要求1所述的反义microRNA-25的组合物作为干预关键氧化应激相关 因子表达的药物的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，含有反义microRNA-25的组合物用于制备 预防和/或治疗抗氧化损伤、抗肿瘤、心衰、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病的药物。
【文档编号】A61P3/10GK106011140SQ201610394192
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】徐国彤, 吕立夏, 张介平
【申请人】同济大学