一种抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸、包括该多核苷酸的表达盒及其应用
【专利摘要】本发明涉及了一种抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸、包括该多核苷酸的表达盒及其应用；包括第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸；所述第一多核苷酸包括EPSP合酶的编码区；所述第二多核苷酸包括营养期杀虫蛋白VIP3A的编码区；所述第三多核苷酸包括杀虫蛋白Cry2A的编码区；可以在植物组织中编码EPSP合酶、营养期杀虫蛋白VIP3A和苏云金芽孢杆菌δ?内毒素即杀虫蛋白Cry2A；还涉及第一表达盒、第二表达盒、第三表达盒和第四表达盒组成DNA构建体，利用DNA构建体转化植物的方法；通过增强协同表达使转基因植物比第一代单基因Bt植物对鳞翅目昆虫具有更强的抗性，且具有耐除草剂的特性，有利于农田除草的进行。
【专利说明】
-种抗除草剂的抗虫植物的多核昔酸、包括该多核昔酸的表 达盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，更具体地，设及一种抗除草剂的抗虫植物的多核 巧酸、包括该多核巧酸的表达盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 棉花是纺织工业中重要的原料来源，并且占有1.4%的GDP和己基斯坦农业产值的 6.7%。在2013年7月至2014年3月期间，纺织工业获得103.85亿美元的外汇收入。在2013至 2014年期间，棉花作物种植面积为2,806,000公顷，比2012至2013年的2,879,000公顷面积 少2.5%。在2013至2014年期间，相对于1410万包的目标，棉花的产量停留在1280万包，显示 出相对于目标值下降9.2%，W及与上一年度的1300万包产量相比，显示出2.0%的下降（己 基斯坦经济调查，2014年）。
[0003] 害虫是全世界产棉区中棉花作物的重大问题。在己基斯坦，棉花作物主要受到许 多种鱗翅昆虫幼虫的损害，如棉花翠纹金刚钻、美洲棉铃虫、棉红铃虫和粘虫等。运些幼虫 W棉铃或花为食，因此引起直接的巨大产量损失。在2010至2012年，在=个集中的产棉省： 旁遮普省、信德省和俾路支省，公共和私营部口机构已使16个化棉花品种的种子通过了旁 遮普种子理事会(PSC)的临时批准。在16个批准的化棉花品种中（包括一个化棉花杂种），有 15种是含有化ylAc基因（M0N531事件）的，而化棉花杂种GFM-2085表达融合基因化ylAc和 化ylAb(James，2013年）。但由于许多原因，棉花生产在己基斯坦仍然不景气。病毒和害虫对 棉花的侵袭明显阻碍了棉花生产。虽然国家在86%的区域上采用了转基因棉花（单基因 化），运还是在2013至2014年期间收到了棉红铃虫和其他鱗翅目害虫的影响化huhro等人， 2015年)的报道。近年来，在信德省，棉红铃虫已成为常规化棉花品种的真正威胁。棉红铃虫 损害了20~30%的棉花作物的子实(4111116(1，2013年）。尽管化棉花品种8〇11旨11曰'(1-11(8 0- 2)和抗农达Flex(RRF)棉在南部的旁遮普省和信德省市场可W得到，但令人意外的是，农民 们报告了由于在GM品种棉花作物中低水平的化毒素，导致了棉田不断受到害虫的侵害(GM Watch,2014年）。
[0004] 根据W上情景，随着对化毒素产生抗药性的昆虫的数量增加，人们可W想象种植 大田的惨淡前途。化毒素的更低表达水平，非但不能杀死鱗翅昆虫幼虫，反而有助于它们产 生抗性。Bravo等人(2013年)也认为，在转基因植物中使用C巧毒素是导致昆虫出现抗性的 原因。发生了演化而对大田中化作物产生了抗性的昆虫已有记载至少五种不同的昆虫物种 (>日]11?6]131311'旨，2007年；1日6日311]114等人，2008年；8日旨1日，2010年；51:〇'61'等人，2010年； Gassmann等人，2011年）。为了延缓昆虫对含有从苏云金芽抱杆菌产生的杀虫蛋白的转基因 作物产生抗性，采用了"金字塔"策略，该策略利用了能够产生杀死同一种害虫的两种或更 多种毒素的植物(Wei等人，2015年;Brevault等人，2013年）。用于控制昆虫的转基因作物的 扩展包括:该作物品种具有两种或更多种化毒素，W及新的化毒素如营养期杀虫蛋白（VIP) 组合(Tabashn化等人，2009年）。因此，在己基斯坦，开发包括除了化ylAcW外的其他叠加的 化基因的新GM植物的栽培技术成为核屯、，所述新栽培种显示出更高的杀虫毒素祀向表达。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的在于合成一种抗除草剂的抗虫植物的多核巧酸，通过该多核 巧酸，可W在植物组织中编码EPSP合酶、营养期杀虫蛋白VIP3A和杀虫蛋白化y2A，进一步来 说，该多核巧酸可W在绿色组织中祀向表达。
[0006] 实现上述目的，本发明采用如下技术方案:一种抗除草剂的抗虫植物的多核巧酸， 包括:第一多核巧酸、第二多核巧酸和第S多核巧酸；第一多核巧酸包括EPSP合酶的编码 区；第二多核巧酸包括营养期杀虫蛋白VIP3A的编码区；第S多核巧酸包括杀虫蛋白Cry2A 的编码区。
[0007] 作为本发明的一种优选的方案:EPSP合酶的编码区的序列如S EQ ID No. 1所示； 营养期杀虫蛋白VIP3A的编码区的序列如SEQ ID No.2所示;杀虫蛋白Cry2A的编码区的序 列如SEQ ID No.3所示。
[000引作为本发明的一种优选的方案:第一多核巧酸还包括第一 CTP的编码区；第二多核 巧酸还包括第二CTP的编码区；第=多核巧酸还包括第=CTP的编码区。
[0009] 本发明的第二个目的在于提供一种编码EPSP合酶、营养期杀虫蛋白VIP3A和杀虫 蛋白Cry2A的表达盒，该表达盒通过增强协同表达使转基因植物比第一代单基因化植物对 鱗翅目昆虫具有更强的抗性，且具有耐除草剂的特性，有利于农田除草的进行。
[0010] 实现上述目的，本发明采用如下技术方案:表达盒包括第一表达盒、第二表达盒、 第=表达盒和第四表达盒。
[0011] 作为本发明的一种优选的方案，第一表达盒包括上述的第一多核巧酸、第一启动 子和第一终止子。
[0012] 优选地，第一启动子为花挪菜花叶病毒35S启动子。
[0013] 优选地，第一表达盒还包括第一 5 '非编码区；第一 5 '非编码区侧接在第一 CTP的编 码区与第一启动子之间。
[0014] 再优选地，第一 5'非编码区包括第一内含子。
[001引再优选地，第一内含子来自陆地棉SCFP基因、油菜叶绿素 a/b结合蛋白基因或矮牵 牛叶绿素 a/b结合蛋白基因的其中之一。
[0016] 作为本发明的一种优选的方案，第二表达盒包括上述的第二多核巧酸、第二启动 子和第二终止子。
[0017] 优选地，第二启动子为花挪菜花叶病毒35S启动子或裂叶牵牛亮氨酸拉链启动子。
[0018] 优选地，第二表达盒还包括第二5 '非编码区；第二5 '非编码区侧接在第二CTP的编 码区与第二启动子之间。
[0019] 再优选地，第二5'非编码区包括第二内含子。
[0020] 再优选地，第二内含子来自陆地棉SCFP基因、油菜叶绿素 a/b结合蛋白基因或矮牵 牛叶绿素 a/b结合蛋白基因的其中之一。
[0021] 作为本发明的一种优选的方案，第=表达盒包括上述的第=多核巧酸、第=启动 子和第=终止子。
[0022] 优选地，第=启动子为花挪菜花叶病毒35S启动子、裂叶牵牛亮氨酸拉链启动子或 GhSCFP启动子的其中之一。
[0023] 优选地，第S表达盒还包括第S5 '非编码区；第S5 '非编码区侧接在第SCTP的编 码区与第S启动子之间。
[0024] 再优选地，第=5'非编码区包括第=内含子。
[0025] 再优选地，第S内含子来自陆地棉SCFP基因、油菜叶绿素 a/b结合蛋白基因、矮牵 牛叶绿素 a/b结合蛋白基因或裂叶牵牛亮氨酸拉链基因的其中之一。
[0026] 作为本发明的一种优选的方案，第四表达盒包括第四启动子、标记基因和第四终 止子。
[0027] 优选地，标记基因为潮霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因。
[0028] 本发明的第=个目的在于提供一种通过将多核巧酸构建表达盒并用于植物的蛋 白表达上，具体地说，给出了苏云金芽抱杆菌S-内毒素即杀虫蛋白Cry2A、营养期杀虫蛋白 VIP3A和EPSP合酶的显著增强表达方法。
[0029] 实现上述目的，本发明采用如下技术方案:一种抗除草剂的抗虫植物的多核巧酸 的应用，将多核巧酸构建表达盒并用于植物的蛋白表达上。
[0030] 作为本发明的一种优选的方案，植物的蛋白表达为祀向叶绿体的蛋白表达。
[0031] 优选地，植物的蛋白表达步骤包括：
[0032] 1)利用上述的第一多核巧酸构建第一表达盒;利用上述的第二多核巧酸构建第二 表达盒;利用上述的第=多核巧酸构建第=表达盒;构建上述的第四表达盒；
[0033] 2)用步骤1)获得的第一表达盒、第二表达盒、第=表达盒和第四表达盒组成DNA构 建体，通过DNA构建体转化植物，使得植物表达融合蛋白。
[0034] 再优选地，步骤2)中:DNA构建体转化植物为通过±壤杆菌介导的转化方法实现。
[0035] 再优选地，步骤2)中，DNA构建体被克隆到质粒载体上，然后被导入植物基因组中； 其中，第一表达盒、第二表达盒、第S表达盒和第四表达盒位于相同或不同的T-DNA区上。
[0036] 再优选地，植物的蛋白表达还包括步骤3):对已转化的植物进行检验。
[0037] 其中，步骤3)为提取已转化的植物的DNA，通过PCR技术进行扩增，检验DNA构建体 的表达情况;PCR的扩增引物如SEQ ID No.4-15所示。
[0038] 本发明所述的多核巧酸、表达盒及植物的蛋白方法适用于包括纤维、豆芙、块茎或 果实植物在内的单子叶植物或双子叶植物;所述优选的单子叶植物可W为玉米、水稻、小麦 和甘薦植物;所述优选的双子叶植物可W为棉花、番茄和马铃馨植物。
[0039] 本发明所述的表达蛋白的植物包括但不限于植物的部分、植物组织，例如种子、叶 子的细胞。
[0040] 本发明的术语:侵害，是指被一种或多种昆虫害虫侵染、食用或伤害植物或植物的 部分。
[0041] 本发明的有益效果在于：
[0042] 1.本发明通过构建表达盒在植物中表达营养期杀虫蛋白VIP3A和杀虫蛋白化y2A; 营养期杀虫蛋白VIP3A和杀虫蛋白Cry2A不具有同源性，在植物体中通过不同的杀虫机理进 行联合作用，使植物体抵抗鱗翅目的昆虫，降低使用化学农药的需求;进一步地，能够抵抗 对常规杀虫蛋白甚至是对化ylAS-内毒素已经产生抗性的昆虫，达到协同效果;并且降低由 昆虫害虫所致的产量损失;所述鱗翅目物种包括实夜蛾属物种化eliothis SP.)、铃夜蛾属 物种（Helicoverpa sp.)、红铃虫属物种（Pectinophora sp.)和灰翅夜蛾属物种 (Spodoptera s p.)等；
[0043] 2.本发明通过构建表达盒在植物中编码EPSP合酶，使植物具有抗除草剂的特性， 除草时不需使用选择性除草剂，可少次大规模喷洒非选择性的除草剂，节省了人工除草的 成本，除草效率大大提高并获得更好的产量；
[0044] 3.本发明通过接入CTP的编码区，将表达盒导向至叶绿体中表达，S种蛋白均表现 出更高的表达水平，进一步减少昆虫产生抗性的机会;=种蛋白协同作用，使植物具有更强 的适应能力；而且，=种蛋白的更高水平表达，未对转基因植物的正常表型和农艺特性产生 不良影响；
[0045] 4.本发明掲示了可编码EPSP合酶、营养期杀虫蛋白VIP3A和杀虫蛋白Cry2A的植物 环境，使得编码W上=种蛋白的过程得W在同一植物体中进行；
[0046] 5.本发明可W表达出比现有技术高出30倍W上的EPSP合酶、营养期杀虫蛋白 VIP3A和S-内毒素即杀虫蛋白Cry2A。
【附图说明】
[0047] 图1为实施例9中PCR反应的流程图。
【具体实施方式】
[0048] 下面，结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0049] 由于农田中杂草的生长，与作物竞争阳光和养分，导致作物大量的产量损失。农民 们W常规方式通过翻±耕作技术或通过施用除草剂W控制农场中的杂草。翻±是有效而麻 烦的，并需要密集的劳动、时间和金钱。而另一方面，除草剂不能在作物植物与杂草植物之 间进行区分，因此保守的农业系统仅能使用具有选择性的除草剂。运样的除草剂不损害作 物，但并非有效去除所有类型的杂草。如果种植抗除草剂的作物，农民们就能W单次施用非 选择性除草剂的方式迅速去除所有杂草。运是节省成本、劳力和时间的方式，因为只需要更 少的非选择性除草剂、更少的劳力、在农田上更少的行程、W及更低的操作成本就可W实 现。草甘麟是限制EPSP合酶的非选择性广谱除草剂，EP SP合酶为芳香族氨基酸和维生素合 成途径中的关键酶。草甘麟抑制例如莽草酸途径，所述莽草酸途径通向包括氨基酸的芳香 族化合物和维生素的生物合成。具体地说，草甘麟通过抑制酶5-締醇式丙酬酷莽草酸-3-憐 酸合酶（5-Enolpy;ruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPS P合酶或EPSPS)而抑制憐 酸締醇式丙酬酸和3-憐代莽草酸转化为5-締醇式丙酬酷-3-憐代莽草酸。因此，一旦EPSP合 酶被阻断，植物就等于被剥夺了营养，最后死亡。草甘麟对控制杂草有用，而对动物生命没 有显著的直接影响，并且不是持续性作用的。所W草甘麟是高度有效的，并且可W使用的最 安全的农业化学品。但是，它对于作物同样有效。所W，可W通过几种方式用于将作物修饰 为对草甘麟耐受。其中一种方法是通过插入编码运种酶的转基因而赋予补充的EPSP合酶允 许细胞抵抗草甘麟的作用。
[0050] 苏云金芽抱杆菌是革兰氏阳性±壤细菌，因其产生对多种鱗翅目、銷翅目和双翅 目昆虫幼虫具有毒性的伴抱晶体蛋白和营养期杀虫蛋白VIP而众所周知。由苏云金芽抱 杆菌在芽抱形成期间产生晶体蛋白，运些晶体蛋白主要对某些侵害作物的昆虫物种有毒 性。包含产生具有杀虫活性的晶体毒性蛋白的化菌株的各种组合物，由于它们对目标昆虫 具有毒性而对植物和其他有益非目标的生物无毒性，所W已经作为可被接受的局部杀虫剂 并在商业上使用。昆虫幼虫摄取其中产生的S-内毒素晶体，S-内毒素晶体会在昆虫的中肠 中溶解之后释放出S-内毒素的原毒素蛋白，随后通过中肠蛋白酶将其加工成活性毒素。活 化的毒素通过受体蛋白识别并结合昆虫中肠上皮的刷状缘。分子遗传学技术使分子生物学 家能够识别和分离各种S-内毒素基因并确定它们的DNA序列。运些基因在高等作物植物中 被进一步截短W便有效利用并且用来开发经批准并供商业使用的遗传工程化的化产品。
[0051] 另一方面，近年来，已经表达出在苏云金芽抱杆菌的营养生长期期间表达的多种 杀虫蛋白。与广泛研究的苏云金芽抱杆菌S-内毒素、或杀虫晶体蛋白作对比，运些营养期杀 虫蛋白VIP主要在芽抱形成期间形成类抱子包含体。VIP已显示出宽的杀虫谱，包括对多种 多样的鱗翅目、W及銷翅目害虫。营养期杀虫蛋白中的VIP3A的有趣特征之一在于，它与已 知的S-内毒素没有序列同源性。已经在昆虫中肠上皮进行水平检验和确认了 VIP3A的作用， 在其结合到中肠细胞上之后引起上皮层的渐进性恶化。
[0052] 基于W上，本发明设计了多核巧酸序列、表达盒及由其构成的D NA构建体，W利用 编码叶绿体转运肤(Chloroplast Transit化ptide，CTP)信号的序列将多肤的表达精确祀 向到经过转化的植物的叶绿体中。
[0053] 有相关报导指出，耐除草剂化T)基因、Cry2Ab和VIP3A的祀向和非祀向（胞质）叶绿 体表达显示，相对于未用信号肤转化的植物，在定位叶绿体的蛋白水平方面，用叶绿体祀向 信号转化的植物中HTXry2Ab和VIP3A表现出显著的增强。标记在需要表达蛋白的基因的编 码序列的5'端的运些CTP信号有助于在细胞加工（如转录、翻译和编码蛋白的表达)之后使 得转基因在叶绿体祀向能够增强表达。通过CTP信号肤的引导，增加了获得在形态学和表型 上正常的植物的频率。
[0054] 为了通过高剂量策略提供一个补充性的保护，W对抗昆虫抗药性的发展，在植物 中增加杀虫转基因的表达显得特别有价值。转基因的增强表达也是在期望之中的，因为在 由于环境条件使得杀虫基因表达降低的情况下，植物中新的转基因会提供持续的保护，W 抵抗昆虫。
[0化日]一、多核巧酸的构建：
[0056] 一种抗除草剂的抗虫植物的多核巧酸，包括第一多核巧酸、第二多核巧酸和第= 多核巧酸；
[0057] 第一多核巧酸包括:EPSP合酶的编码区和第一 CTP的编码区；EPSP合酶的编码区连 接在第一CTP的编码区的3'端;EPSP合酶的编码区的序列如SEQ ID No.l所示；
[005引第二多核巧酸包括:营养期杀虫蛋白VIP3A的编码区和第二CT P的编码区；营养期 杀虫蛋白VIP3A的编码区连接在第二CTP的编码区的3'端;营养期杀虫蛋白VIP3A的序列如 沈Q ID No.2所示；
[0059] 第=多核巧酸的序列包括:杀虫蛋白化y2A的编码区和第=CT P的编码区；杀虫蛋 白Cry2A的编码区连接在第SCTP的编码区的3'端；杀虫蛋白Cry2A的编码区的序列如SEQ ID No.3所示。
[0060] 用叶绿体转运肤(CTP)经过转化而表达具有草甘麟抗性的蛋白质的植物，所述CTP 将肤祀向至细胞的叶绿体。由于除草剂草甘麟通过中断尤其是细胞的叶绿体中的芳香族氨 基酸和维生素的生物合成过程而发挥杀死细胞的作用，所W通过CTP使得在祀向的叶绿体 中集中表达细胞的草甘麟抗性酶，达到增加对除草剂的抗性的效果。另外，本发明还通过类 似的方法，使得杀虫毒素 Cry2A和VIP3A在绿色组织(例如叶，为巧嚼昆虫的主要目标）中有 高的水平积累。因此，运些浓集的毒素在控制鱗翅目昆虫幼虫方面相当有效。
[0061] 本发明优选的CTP包括将转基因祀向至叶绿体的CTP。优选CT P的特定实例包括矮 牵牛EPSP合酶CTP、矮牵牛叶绿素 a/b结合蛋白（Qiloro地yll a/b binding protein,Cab) CTPW及藍麻叶绿素 a/b结合蛋白（Qiloro地yll a/b binding p;rotein，(^ib)CTP。
[0062] 二、表达盒的构建：
[0063] -种抗除草剂的抗虫植物的表达盒，包括第一表达盒、第二表达盒、第=表达盒和 第四表达盒；
[0064] 第一表达盒包括第一启动子、第一5'非编码区、上述的第一多核巧酸和第一终止 子;第一5'非编码区侧接在第一CTP的编码区与第一启动子之间，第一启动子连接在第一5' 非编码区的5'端，第一CT P的编码区连接在第一5'非编码区的3'端；第一终止子连接在 EPSP合酶的编码区的3'端。
[0065] 第一5'非编码区包括第一内含子;第一内含子为矮牵牛叶绿素 a/b结合蛋白基因 的第二内含子序列，还可W是来自矮牵牛叶绿素 a/b结合蛋白基因的第一内含子序列、陆地 棉SCFP基因或油菜叶绿素 a/b结合蛋白基因；第一启动子为花挪菜花叶病毒35S(化mV35S) 启动子;第一终止子为姻脂碱合酶(NOS)多聚腺巧酸化序列，还可W是能够接合在第一多核 巧酸3'端的其他终止子。
[0066] 第二表达盒包括第二启动子、第二5'非编码区、上述的第二多核巧酸和第二终止 子;第二5'非编码区侧接在第二CTP的编码区与第二启动子之间，第二启动子连接在第二5' 非编码区的5'端，第二CT P的编码区连接在第二5'非编码区的3'端，第二终止子连接在营 养期杀虫蛋白VIP3A的编码区的3'端。
[0067] 第二5'非编码区包括第二内含子;第二内含子为油菜叶绿素 a/b结合蛋白基因的 第一内含子序列，还可W是来自陆地棉SCFP基因、矮牵牛叶绿素 a/b结合蛋白基因的第一或 第二内含子序列;第二启动子为花挪菜花叶病毒35S启动子，还可W是裂叶牵牛亮氨酸拉链 (I pomoea nil leucine zipper,PNZIP)启动子及其同源非编码区，裂叶牵牛亮氨酸拉链 启动子的序列如SEQ ID No.16所示;第二终止子为姻脂碱合酶多聚腺巧酸化序列，还可W 是能够接合在第二多核巧酸3'端的其他终止子。
[0068] 第=表达盒包括第=启动子、第=5'非编码区、上述的第=多核巧酸和第=终止 子;第=5'非编码区侧接在第=CTP的编码区与第=启动子之间，第=启动子连接在第=5' 非编码区的5'端，第SCT P的编码区连接在第S5'非编码区的3'端，第S终止子连接在杀 虫蛋白化y2A的编码区的3'端。
[0069] 第S5'非编码区包括第S内含子;第S内含子为陆地棉SCFP基因的第一内含子序 列，还可W是来自油菜叶绿素 a/b结合蛋白基因、矮牵牛叶绿素 a/b结合蛋白基因的第一或 第二内含子序列、或裂叶牵牛亮氨酸拉链的第一内含子序列;第S启动子为化SCFP启动子， 还可W是花挪菜花叶病毒35S启动子或裂叶牵牛亮氨酸拉链启动子及其同源非编码区；裂 叶牵牛亮氨酸拉链启动子的序列如SEQ ID No. 16所示;第=终止子为姻脂碱合酶多聚腺巧 酸化序列，还可W是能够接合在第=多核巧酸3'端的其他终止子。
[0070] 所述第四表达盒包括第四启动子、标记基因和第四终止子;第四启动子连接在标 记基因的5 '端，第四终止子连接在标记基因的3 '端。
[0071] 所述第四启动子为花挪菜花叶病毒35S启动子;所述标记基因为潮霉素抗性基因 或卡那霉素抗性基因；所述潮霉素抗性基因可W表达出具有潮霉素抗性的蛋白；所述卡那 霉素抗性基因可W表达出具有卡那霉素抗性的蛋白；第四终止子为姻脂碱合酶多聚腺巧酸 化序列，还可W是能够接合在标记基因3 '端的其他终止子。
[0072] 为了在功能上完成特异性表达，可W通过导入组成型表达基因来进行表达，运些 组成型表达基因被附接到某种适合的转运肤上的，所述转运肤的侧翼为在3'端的基因和接 近转运肤5'端的启动子。例如当编码来自苏云金芽抱杆菌的营养期杀虫蛋白VIP3A的基因 被导入到转运肤时，利用花挪菜花叶病毒35S等启动子，它能够在所有组织中表达。
[0073] 内含子也可被包含在用于单子叶和双子叶植物中优化表达的DN A表达构建体中。 典型地朝向DNA的非编码序列插入运样的内含子。基于内含子的特性，内含子在本发明中是 有价值的。
[0074] 用于在转基因植物中进行基因表达的有组织特异性祀向的质粒载体的设计，一般 包括组织特异性启动子和还可包括其他组织特异性控制元件，如增强子序列。
[00巧]S、植物的蛋白表达：
[0076] 包括W下步骤：
[0077] 1)将上述第一表达盒、第二表达盒、第=表达盒和第四表达盒组成DNA构建体;然 后克隆到二元质粒载体的T-DNA区的左边界序列和右边界序列之间，获得已插入表达盒的 质粒载体;然后被导入植物基因组中；
[0078] 其中第一表达盒、第二表达盒、第S表达盒和第四表达盒位于相同或不同的T-DNA 区上；
[0079] 可W是第一表达盒、第二表达盒、第S表达盒和第四表达盒位于相同的T-DNA区 上；
[0080] 可W是第一表达盒、第二表达盒和第四表达盒位于相同的T-DN A区上；
[0081] 可W是第二表达盒、第=表达盒和第四表达盒位于相同的T-DN A区上；
[0082] 也可W是第一表达盒、第S表达盒和第四表达盒位于相同的T-D NA区上；
[0083] 2)DNA构建体转化植物为通过±壤杆菌介导的转化方法实现:使用的±壤杆菌电 穿孔转化技术，步骤1)中获得的质粒载体被转化到根癌±壤杆菌中，通过根癌±壤杆菌侵 染植物，使得植物表达融合蛋白；
[0084] 3)通过标记基因对应的潮霉素或卡那霉素选择成功转化的细胞；
[0085] 4)对已转化的植物进行检验;检验的方法包括但不限于:化内毒素的分离、氨基酸 测序、回译、寡核巧酸探针的设计，随后为通过杂交进行基因的鉴定和克隆；
[0086] 具体可通过W下方法中的至少一种进行：
[0087] I)从叶中提取DNA，并且使用基因特异性引物序列（SEQ I D ^.4-15)通过1^斗0? 反应检验转基因：EPSP合酶、VIP3A和C ry2A在驯化的假定转基因植物中是否存在；
[0088] n )通过对EPSP合酶、VIP3A和化y2A特异的酶联免疫吸附试验巧LISA)测定通过分 析提取的蛋白质样品；
[0089] 虹)通过草甘麟喷雾测定;观察已转化的植物是否表现出对草甘麟的抗性；同时通 过实验室昆虫生物测定来鉴定和筛选阳性植物事件对鱗翅目昆虫的杀虫活性;所述鱗翅目 昆虫即：美洲棉铃虫化elico ve;rpa armigera)、棉花翠纹金刚钻化arias insulana)、秋粘 虫（Spo dopter曰 frugiperd曰）和棉红铃虫(Pictinophor曰 gossypiell曰）。
[0090] 具体实施例
[0091] 实施例1-2用于说明表达盒的构建及过程：
[0092] 实施例1
[0093] -种抗除草剂的抗虫植物的表达盒:包括第一表达盒、第二表达盒、第=表达盒和 第四表达盒；
[0094] 第一表达盒包括第一启动子、141bp长的第一 5'非编码区、第一多核巧酸和第一终 止子;第一多核巧酸包括EPSP合酶的编码区和108bp长的第一 CTP的编码区；
[00M]第一启动子连接在第一 5'非编码区的5'端;第一 CTP的编码区连接在第一 5'非编 码区的3'端，第一5'非编码区和第一CTP的编码区相连接的序列如SEQ ID No. 17所示;EPSP 合酶的编码区连接在第一 CTP的编码区的3'端;第一终止子连接在EPSP合酶的编码区的3' 玉山 乂而。
[0096] 第一 CTP的编码区为矮牵牛叶绿素 a/b结合蛋白CTP基因；第一 CTP的编码区与EPSP 合酶的编码区构成第一多核巧酸的序列如SEQ ID No. 18所示；由第一多核巧酸的序列编码 得到的多肤序列如S EQ ID No. 19所示。
[0097] 第一5'非编码区包括第一内含子;第一内含子为矮牵牛叶绿素 a/b结合蛋白基因 的第二内含子序列；
[0098] 第一启动子为花挪菜花叶病毒35S启动子；
[0099] 第一终止子为姻脂碱合酶多聚腺巧酸化序列。
[0100] 第二表达盒包括第二启动子、99bp长的第二5'非编码区、第二多核巧酸和第二终 止子;第二多核巧酸包括营养期杀虫蛋白VIP3A的编码区和144bp长的第二CTP的编码区；
[0101] 第二启动子连接在第二5'非编码区的5'端;第二CTP的编码区连接在第二5'非编 码区的3'端，第二5'非编码区和第二CTP的编码区相连接的序列如SEQ ID No.20所示;营养 期杀虫蛋白VIP3A的编码区连接在第二CTP的编码区的3'端;第二终止子连接在营养期杀虫 蛋白VIP3A的编码区的3'端。
[0102] 第二CTP的编码区为藍麻叶绿素 a/b结合蛋白CTP基因；第二CTP的编码区与营养期 杀虫蛋白VIP3A的编码区构成第二多核巧酸的序列如SEQ ID No. 21所示；由第二多核巧酸 的序列编码得到的多肤序列如SEQ ID No.22所示。
[0103] 第二5'非编码区包括第二内含子;第二内含子为油菜叶绿素 a/b结合蛋白基因的 第一内含子序列；
[0104] 第二启动子为花挪菜花叶病毒35S启动子；
[0105] 第二终止子为姻脂碱合酶多聚腺巧酸化序列。
[0106] 第=表达盒包括第=启动子、177bp长的第=5'非编码区、第=多核巧酸和第=终 止子;第=多核巧酸包括杀虫蛋白化y2A的编码区和21化P长的第=CTP的编码区；
[0107] 第S启动子连接在第S5'非编码区的5'端;第SCTP的编码区连接在第S5'非编 码区的3'端，第S5'非编码区和第SCTP的编码区相连接的序列如SEQ ID No.23所示;杀虫 蛋白Cry2A的编码区连接在第SCTP的编码区的3'端;第S终止子连接在杀虫蛋白Cry2A的 编码区的3'端。
[0108] 第SCTP的编码区为矮牵牛EPSP合酶CTP基因；第SCTP的编码区与杀虫蛋白化y2A 的编码区构成第=多核巧酸的序列如SEQ ID No.24所示；由第=多核巧酸的序列编码得到 的多肤序列如SEQ ID No.25所示。
[0109] 第S5'非编码区包括第S内含子;第S内含子为陆地棉SCFP基因的第一内含子序 列；
[0110] 第S启动子为化SCFP启动子；
[0111] 第=终止子为姻脂碱合酶多聚腺巧酸化序列。
[0112] 第四表达盒包括第四启动子、标记基因和第四终止子;第四启动子连接在标记基 因的5 '端，第四终止子连接在标记基因的3 '端。
[0113] 第四启动子为花挪菜花叶病毒35S启动子；
[0114] 标记基因为卡那霉素抗性基因；
[0115] 第四终止子为姻脂碱合酶多聚腺巧酸化序列。
[0116] 实施例2
[0117] 实施例1中的每一个表达盒均通过W下过程制备：
[0118] CTP的编码序列可操作地结合在包括相应的启动子的5'非编码区的3'端;然后进 一步标记到EPSP合酶的编码区、营养期杀虫蛋白VIP3A的编码区或杀虫蛋白化y2A的编码区 的DNA序列5 '端上;相应的终止子进一步连接在编码蛋白的DNA序列的3 '端上。
[0119] 实施例3
[0120] 本实施例用于说明获得载体的过程：
[0121] 1)将实施例1和实施例2获得的第一表达盒、第二表达盒、第=表达盒和第四表达 盒克隆到质粒载体的相同T-DNA的左边界序列和右边界序列之间，T-DNA的序列如SEQ ID No. 26所示;获得已插入表达盒的载体；
[0122] 2)使用的±壤杆菌电穿孔转化技术，步骤1)中获得的质粒载体被转化到根癌±壤 杆菌LB4404菌株中，通过根癌±壤杆菌侵染植物。
[0123] 实施例4
[0124] 本实施例用于说明植物的转化过程：
[0125] W优化的陆地棉CV FB202和FB203的萌动胚通过实施例3获得的±壤杆菌介导的 转化方法再生转基因棉花植物，包括W下步骤：
[0126] 1)将除去纤维的。8202和。8203种子置于烧瓶中，用5%505和5%氯化隶覆盖种子 表面，不断旋转烧瓶进行表面消毒60S;然后在无菌水中洗涂种子直到没有可见的泡沫为 止；
[0127] 2)将消毒的种子浸泡在lOmL的经高压灭菌的蒸馈水中。用黑布覆盖烧瓶，并且允 许种子在黑暗中在30°C萌发36h，然后分离胚；
[01%] 3)使用选择抗生素，独立地在YEP培养液中将lOmL的含有D NA构建体的±壤杆菌 培养物培养过夜；
[0129] 4)4°C将培养物离屯、，将沉淀溶解在10血的MS培养液中，将混合物进一步用MS培养 液稀释在新的无菌的50mL离屯、管(化1 con Tube)中；
[0130] 5)取出萌发的棉花胚，手工去除种皮W及子叶组织;将每个分离的胚朝向茎尖做 一个小切口，并且放置在补充有乙酷下香酬(Sig ma-Al化ich?)的稀释的上壤杆菌培养混 合物中，在设置为30°C的摇床中共培养化；
[0131] 6)将经±壤杆菌处理过的胚在无菌滤纸上吸干，W去除多余的细菌;将胚转移到 含MS培养基的平板上；用石蜡膜包住平板并将其在光照下在28-30°C解育S天;所述胚在尺 寸上增大并且变为绿色；
[0132] MS培养基的成分为:MS盐、B5维生素、2mg/L糞乙酸、0.1 m g/L激动素、30g/L薦糖、 4g/L组培凝胶、500mg/L头抱霉素;调节P H=5.8;
[0133] 7)在第四天，将健康生长的胚从平板转移到包含补充有选择抗生素的MS培养基 (与上文相同的组成）的25x200mm的试管中，将试管在1地光照和lOh黑暗条件下保持S至四 个月，直到健康的茎芽形成时为止;在运个期间，每隔=周，将茎芽转移到新鲜的含选择抗 生素的MS培养基上；
[0134] 8)将充分发育的茎芽转移到补充有激素并且不含选择抗生素的生根MS培养基上； 然后，将带有健康根的茎芽赋予"假定转基因植物"的身份，并且转移到含有上壤、泥炭小盆 中，使运些植物驯化。
[0135] 实施例5
[0136] 本实施例用于说明转基因的鉴定和选择：
[0137] 采用W下=种方法，对实施例4获得的植物的转基因进行鉴定：
[0138] 1)从叶中提取DNA，并且使用基因特异性引物序列（SEQ ID ^).4-15)通过^斗0? 反应检验转基因：EPSP合酶、VIP3A和化y2A在驯化的假定转基因植物中是否存在；
[0139] 2)通过对EPSP合酶、VIP3A和化y2A特异的酶联免疫吸附试验化LISA)测定通过分 析提取的蛋白质样品；
[0140] 3)通过草甘麟喷雾测定:观察已转化的植物是否表现出对草甘麟的抗性；同时通 过实验室昆虫生物测定来鉴定和筛选阳性植物事件对鱗翅目昆虫的杀虫活性。
[0141] 实施例6-7用于说明抗体的产生及化ISA试验过程：
[0142] 实施例6
[0143] 本实施例用于说明抗体的产生和纯化：
[0144] 1)分别用纯化的EPSP合酶、VIP3A和化y2A蛋白在大约重化g的S只雄性白化兔的 多个部位皮下注射；相应地标记运些兔子并进行良好喂养，在十五天之后进一步用蛋白质 注射；
[0145] 2)每只兔子取5mL的血液，通过化ISA检查抗体滴度;在两个月之后通过屯、脏穿刺 分离全血;分离血清并且将其在-20°C下储存;从免疫之前的兔子获得免疫前对照血清；
[0146] 3)在蛋白A亲和树脂上纯化兔单克隆抗EPSP合酶、抗VIP3A和抗Cry2A抗体;将纯化 的抗体在PBS中透析，分配成等分试样，并在-20°C下冷冻储存;再次进行化ISA滴度测定，W 检查每种纯化抗体的活性。
[0147] 实施例7
[0148] 本实施例用于说明抗体的表征：
[0149] -、提取蛋白质：
[0150] 1)在预冷的无菌研鉢边缘，在液氮中分别研磨200mg实施例4获得的转基因植物材 料W及非转基因对照植物材料(叶、茎、根等）；将干的研磨细粉末转移到1.5mL无菌微量离 屯、管化卵endorf tube)中；
[0151] 2)加入300uL的蛋白提取缓冲液，蛋白提取缓冲液的成分为:0.5M EDTA、0.5M甘 油、0.51化(：1、20111]\1化13-肥1抑=7.5、201111畑4(：1、0.51?]\15。、10111]\101'1';通过满旋均 质化之后，将样品在4°C冰箱中解育化至尴夜；
[0152] 3)在4°CW最大速度离屯、15min;将上清液取到另一个微量离屯、管中，并且使用布 拉德福试剂将提取的蛋白质在分光光度计上进行定量；
[0153] 4)将运些样品W1:10稀释，用于进一步分析。
[0154] 二、酶联免疫吸附测定化LISA):
[0巧日]通过间接化ISA检测在叶绿体W及胞液中表达的EPSP合酶、VIP3A和化y2A。
[0156] 1)先将植物蛋白样品和苏云金芽抱杆菌菌株的周质部分分别在沸水中保持lOmin W便使内源碱性憐酸酶或激酶的酶活性变性；
[0157] 2)将所有的变性样品和纯化蛋白与抑= 9.5的50mM碳酸盐缓冲液混合并相应地分 配到96孔微量滴定板中，并且在37°C解育过夜；
[015引3)用his缓冲盐水和吐溫20(TBST)冲洗掉未结合的抗原;通过5%BSA/TBS封闭缓 冲液进行未结合非特异性部位的封闭，并分别与抗GTG化PSP合酶编码基因）、抗&y2A和抗 VIP3A抗体反应；
[0159] 4)在标准洗涂之后，使用BCIP/NBT底物，用AP-羊抗兔IgG检测结合的抗体;通过加 入1N肥1停止化ISA反应；
[0160] 5)在430nm光谱下估计光吸收率，使用阴性对照作为空白；
[0161] 6)利用标准品，绘制在不同浓度的标准品的光密度(0D)之间的曲线;通过将反应 产物的对应0D值放在标准曲线上，测定EPSP合酶、Cry2A和VIP3A蛋白的浓度。W下公式用于 蛋白质定量：
[0162]
[0163] S、免疫斑点印迹：
[0164] 进行斑点印迹分析W便迅速筛选含有表达在转基因棉花植物的叶绿体和胞液中 的EPSP合酶、VIP3A蛋白和/或化y2A蛋白的提取的蛋白质样品。
[0165] 1)将变性的化周质部分、纯化蛋白、经过S个基因转化的和非转化的对照蛋白样 品1〇化施加到硝酸纤维素膜上;干燥之后，在5 %BSA/TBS封闭缓冲液中封闭未结合的膜部 分；
[0166] 2)用lx PBS和添加的一级抗体(抗CrylAc、抗EPSP、抗VI P3A兔抗体1:5000)将印 迹洗涂=次，并在37 °C解育化；
[0167] 3)用lx PBS使印迹产生S次洗出物，然后将印迹用二级IgG(AP-兔抗鼠 IgG)培育； 在用抗IgG解育化之后，再用lx PBS和添加的BCIP/NBT底物将印迹洗涂S次，然后在37°C解 育30min，检测得到转基因蛋白。
[016引实施例8-10用于说明PCR的检测过程：
[0169] 实施例8
[0170] 本实施例用于说明DM提取：
[0171] 1)摘取实施例4新鲜的叶样品300mg并且立即保持在液氮容器中，然后研磨。使用 液氮将每个样品用预冷的无菌研鉢和研棒精细研磨；
[0172] 2)取干粉末到干净的微量离屯、管中并与预热的DNA提取缓冲液彻底混合;DNA提取 缓冲液的成分:2%CTAB、1%琉基乙醇、2M化Cl、200mM抓TA和lOOmM lYis-HCl、核糖核酸 酶A;
[0173] 3)在70°C解育30min之后，加入一倍体积pH = 8的苯酪，W最大速度满旋和自旋 lOmin;
[0174] 4)用相等体积的氯仿:异戊醇(24:1)进一步萃取上清液，并再次自旋；
[0175] 5)取上清液并加入0.7倍体积的异丙醇，并在室溫下保持化；
[0176] 6)之后，用70%新鲜制备的乙醇将DNA沉淀洗涂两次，风干，并重悬在50化的无菌 水中；在0.8 %琼脂糖凝胶上将DNA定量。
[0177] 实施例9
[0178] 本实施例用于说明PCR反应：
[0179] 1)使用基因特异性引物沈Q ID NO.4-15:
[0180]
[0181] 在25化的反应体积中进行来自实施例8基因组DNA的GTG化PSP合酶编码基因）、 VIP3A和化y2A的基因进行PCR扩增；
[0182] 2)PCR混合物的组成为：模板DNA200ng、正向和反向基因特异性引物各自20pM; dNTP混合物3mM、lxTaq缓冲液、2单元的化9聚合酶(Thermo Scientific);
[0183] 3)在热循环仪(Applied Biosciences)中进行PCR反应，流程如图1所示，条件如 下：951：5111111;951：303、591：303、721：408进行40个循环；721：7111111;20°(：维持。
[0184] 实施例10
[0185] 琼脂糖凝胶电泳：
[0186] 1)将实施例9的PCR扩增的基因片段在1 % TAE缓冲液中的含0 .加 g/mL漠化乙锭的 1 %琼脂糖凝胶上跑胶；
[0187] 2)PCR混合物中加入4uL的漠苯酪上样染料，然后上样到凝胶孔中；在凝胶电泳仪 (BioRad)中在100V进行电泳30min，在凝胶记录装置(UVP，USA)中在UV下观察，观察得到 GTG、VIP3A和Cry2A基因的条带。
[018引实施例11
[0189] 一种含有第一表达盒、第二表达盒、第=表达盒和第四表达盒的载体;其中，第= 表达盒中的第=启动子为裂叶牵牛亮氨酸拉链启动子;第=内含子为裂叶牵牛亮氨酸拉链 的第一内含子序列;其余结构和参数及载体的获得过程与实施例1-3相同；该载体被命名为 p4BG3 〇
[0190] 对于本领域的技术人员来说，可根据W上描述的技术方案W及构思，做出其它各 种相应的改变W及变形，而所有的运些改变W及变形都应该属于本发明权利要求的保护范 围之内。
【主权项】
1. 一种抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸，其特征在于包括:第一多核苷酸、第二多核苷 酸和第三多核苷酸;所述第一多核苷酸包括EPSP合酶的编码区；所述第二多核苷酸包括营 养期杀虫蛋白VIP3A的编码区；所述第三多核苷酸包括杀虫蛋白Cry2A的编码区。2. 如权利要求1所述的抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸，其特征在于:所述EPSP合酶的 编码区的序列如SEQ ID No.l所示；所述营养期杀虫蛋白VIP3A的编码区的序列如SEQ ID No.2所示;所述杀虫蛋白Cry2A的编码区的序列如SEQ ID No.3所示。3. 如权利要求1所述的抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸，其特征在于:所述第一多核苷 酸还包括第一 CTP的编码区；所述第二多核苷酸还包括第二CTP的编码区；所述第三多核苷 酸还包括第三CTP的编码区。4. 一种抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述表达盒包括第一表达盒、第二 表达盒、第三表达盒和第四表达盒。5. 如权利要求4所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第一表达盒包 括如权利要求3所述的第一多核苷酸、第一启动子和第一终止子。6. 如权利要求5所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第一启动子为 花椰菜花叶病毒35S启动子。7. 如权利要求5所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第一表达盒还 包括第一 5'非编码区;所述第一 5'非编码区侧接在第一 CTP的编码区与第一启动子之间。8. 如权利要求7所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第一 5 '非编码 区包括第一内含子。9. 如权利要求8所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第一内含子来 自陆地棉SCFP基因、油菜叶绿素 a/b结合蛋白基因或矮牵牛叶绿素 a/b结合蛋白基因的其中 之一。10. 如权利要求4所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第二表达盒 包括如权利要求3所述的第二多核苷酸、第二启动子和第二终止子。11. 如权利要求10所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第二启动子 为花椰菜花叶病毒35S启动子或裂叶牵牛亮氨酸拉链启动子。12. 如权利要求10所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第二表达盒 还包括第二5 '非编码区;所述第二5 '非编码区侧接在第二CTP的编码区与第二启动子之间。13. 如权利要求12所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第二5'非编 码区包括第二内含子。14. 如权利要求13所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第二内含子 来自陆地棉SCFP基因、油菜叶绿素 a/b结合蛋白基因或矮牵牛叶绿素 a/b结合蛋白基因的其 中之一。15. 如权利要求4所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第三表达盒 包括如权利要求3所述的第三多核苷酸、第三启动子和第三终止子。16. 如权利要求15所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第三启动子 为花椰菜花叶病毒35S启动子、裂叶牵牛亮氨酸拉链启动子或GhSCFP启动子的其中之一。17. 如权利要求15所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第三表达盒 还包括第三5 '非编码区；所述第三5 '非编码区侧接在第三CTP的编码区与第三启动子之间。18. 如权利要求17所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第三5'非编 码区包括第三内含子。19. 如权利要求18所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第三内含子 来自陆地棉SCFP基因、油菜叶绿素 a/b结合蛋白基因、矮牵牛叶绿素 a/b结合蛋白基因或裂 叶牵牛亮氨酸拉链基因的其中之一。20. 如权利要求4所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述第四表达盒 包括第四启动子、标记基因和第四终止子。21. 如权利要求20所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于:所述标记基因为 潮霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因。22. -种抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸的应用，其特征在于:将多核苷酸构建表达盒 并用于植物的蛋白表达上。23. 如权利要求22所述的抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸的应用，其特征在于:所述植 物的蛋白表达步骤包括： 1) 分别利用权利要求3所述的第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸构建如权 利要求5所述的第一表达盒、如权利要求10所述的第二表达盒、如权利要求15所述的第三表 达盒和如权利要求20所述的第四表达盒； 2) 用步骤1)获得的第一表达盒、第二表达盒、第三表达盒和第四表达盒组成DNA构建 体，通过DNA构建体转化植物，使得植物表达融合蛋白。24. 如权利要求23所述的抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸的应用，其特征在于:所述步 骤2)中:DNA构建体转化植物为通过土壤杆菌介导的转化方法实现。25. 如权利要求23所述的抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸的应用，其特征在于:步骤2) 中，所述DNA构建体被克隆到质粒载体上，然后被导入植物基因组中；其中，所述第一表达 盒、第二表达盒、第三表达盒和第四表达盒位于相同或不同的T-DNA区上。26. 如权利要求23所述的抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸的应用，其特征在于:所述植 物的蛋白表达步骤还包括步骤3):对已转化的植物进行检验。27. 如权利要求26所述的抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸的应用，其特征在于:所述步 骤3)为提取已转化的植物的DNA，通过PCR技术进行扩增，检验DNA构建体的表达情况;所述 PCR的扩增引物如SEQIDNo.4-15所示。
【文档编号】C12N9/10GK106047907SQ201610355078
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】达尼亚·贾德·库雷西·索·贾德·萨利姆·库雷西, 哈姆萨·纳迪姆·库雷西·索·穆罕默德·纳迪姆·库雷西
【申请人】达尼亚·贾德·库雷西·索·贾德·萨利姆·库雷西, 哈姆萨·纳迪姆·库雷西·索·穆罕默德·纳迪姆·库雷西