一种二巯丁二酸的药物组合物及其医药用图
【专利摘要】本发明公开了一种二巯丁二酸的药物组合物及其医药用途，本发明提供的二巯丁二酸的药物组合物中含有二巯丁二酸和一种结构新颖的天然产物化合物(Ⅰ)，二巯丁二酸、化合物(Ⅰ)单独作用时，对免疫性血小板减少性紫癜具有治疗作用；二巯丁二酸和化合物(Ⅰ)联合作用时，对免疫性血小板减少性紫癜的治疗效果显著提高，可以开发成治疗免疫性血小板减少性紫癜的药物，与现有技术相比具有突出的实质性特点和显著的进步。
【专利说明】
一种二巯丁二酸的药物组合物及其医药用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及二巯丁二酸的新用途，具体涉及二巯丁二酸的药 物组合物及其医药用途。
【背景技术】
[0002] 二巯丁二酸是一种解毒剂，临床上常用于治疗铅、汞、砷、锑中毒，对铜有促排作 用，适用于肝豆状核变性的治疗。
[0003] 迄今为止，尚未见二巯丁二酸及其药物组合物与免疫性血小板减少性紫癜的相关 性报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种二巯丁二酸的药物组合物，该药物组合物中含有二巯 丁二酸和一种结构新颖的天然产物，二巯丁二酸和该天然产物可协同治疗免疫性血小板减 少性紫癜。
[0005] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0006] 一种具有下述结构式的化合物（I)，
[0007]
；〇
[0008] -种二巯丁二酸的药物组合物，包括二巯丁二酸、如权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可以接受的载体，制备成需要的剂型。
[0009] 进一步地，药学上可以接受的载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、 崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂。
[0010] 进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、 膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
[0011] 上述化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将贯叶金丝桃粉碎，用75~ 85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正 丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中正丁醇 取物用大孔树脂除杂，先用25%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙醇洗脱12个柱体积，收集 70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70%乙醇洗脱浓缩物用正相 硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组 分；⑷步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、15:1和1:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离， 用体积百分浓度为72 %的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~16个柱体积洗脱液，洗脱液减压 浓缩得到化合物(I)。
[0012] 进一步地，化合物（I)的制备方法中，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂。
[0013] 上述化合物(I)在制备治疗免疫性血小板减少性紫癜的药物中的应用。
[0014] 上述二巯丁二酸的药物组合物在制备治疗免疫性血小板减少性紫癜的药物中的 应用。
[0015] 本发明的优点：
[0016] 本发明提供的二巯丁二酸的药物组合物中含有二巯丁二酸和一种结构新颖的天 然产物，二巯丁二酸、化合物（I)单独作用时，对免疫性血小板减少性紫癜具有治疗作用;二 巯丁二酸和化合物（I)联合作用时，对免疫性血小板减少性紫癜的治疗效果显著提高，可以 开发成治疗免疫性血小板减少性紫癜的药物。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0018] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证
[0019]分离方法：（a)将贯叶金丝桃(2kg)粉碎，用80 %乙醇热回流提取（15L X 3次），合并 提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次)和水饱和的正丁 醇（3LX3次）萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤(a) 中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔树脂除杂，先用25 %乙醇洗脱8个柱体积，再用70 %乙醇洗 脱12个柱体积，收集70 %洗脱液，减压浓缩得70 %乙醇洗脱浓缩物；（c)步骤(b)中70 %乙醇 洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1 (10个柱体积）、45:1 (8个柱体积）、25:1 (10个柱体积)和15:1(8个柱体积）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤(c)中 组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(10个柱体积）、15:1(8个柱体积)和1:1 (6个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷 键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为72%的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~16个柱体 积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物（I) (HPLC归一化纯度大于98% )。
[0020] 结构确证:册431-]\^显示[]\?1]+为111/2 523.3022，结合核磁特征可得分子式为 C32H42〇6，不饱和度为 12。核磁共振氢谱数据δΗ(ppm，DMS〇-d6，600MHz): H-1 (6 · 06，d，J = 12.9Hz)，H-2(5.88，d，J=12.9Hz)，H-4(4.35，qd，J = 6.5,4.4Hz)，H-5(2.34，dd，J = 4.4， 3.8Hz)，H-6(2.59，dd，J = 4.2,3.8Hz)，H-7(2.48，dd，J = 4.2,3.7Hz)，H-8(1.85，d，J = 3.7Hz)，H-ll(1.50，m)，H-ll(2.10，m)，H-12(1.63，m)，H-12(1.71，m)，H-15(1.28，m)，H-15 (2.34，dd，J=14.9,7.3Hz)，H-16(5.32，m)，H-16b(2.05，s)，H-17(2.51，m)，H-18(1.08，s)， H-19(0.97，d，J = 4.3Hz)，H-19(1.98，d，J = 4.3Hz)，H-21(1.81，s)，H-22(6.61，s)，H-24a (5.85，s)，H-24a(6.04，s)，H-25(2.88，m)，H-26(1.03，d，J = 6.6Hz)，H-27(1. ll，d，J = 6 · 6Hz)，H-28 (1 · 27，d，J = 6 · 7Hz)，H-30 (0 · 99，s);核磁共振碳谱数据心（卯m，DMS〇-d6， 150MHz):150.2(CH，卜C)，119.6(CH，2-C)，168.5(C，3-C)，73.5(CH，4-C)，52.8(CH，5-C)， 56.7(CH，6-C)，55.6(CH，7-C)，49.2(CH，8-C)，30.2(C，9-C)，37.0(C，10-C)，28.5(CH2，n-C)，32.6(CH2，12-C)，45.2(C，13-C)，47.3(C，14-C)，46.9(CH2，15-C)，77.1(CH，16-C)，170.2 (C，16a-C)，22.3(CH 3，16b-C)，59.5(CH，17-C)，18.5(CH3，18-C)，32.5(CH2，19-C)，162.4(C， 20-C)，16.8(CH 3,21-C)，126.6(CH，22-C)，194.8(C，23-C)，154.3(C，24-C)，119.8(CH2,24a-C)，29.5(CH，25-C)，22.1(CH3,26-C)，21.8(CH3,27-C)，18.8(CH3,28-C)，20.1(CH 3,30-C)。 IR谱图中的1715CHT1与1694CHT1吸收带表明该化合物结构中存在羰基与共辄羰基;UV谱图 中的最大吸收207nm与245nm说明结构中存在共辄双键。氢谱核磁数据表明该结构中不饱和 度是由三个C-C双键结构，三个羰基结构以及六个环状骨架组成。碳谱核磁数据与DEPT谱数 据表明该化合物结构中含有32个碳，其中有七个甲基，五个亚甲基(一个烯属亚甲基），十一 个次甲基(三个烯属次甲基，四个含氧次甲基），九个季碳(一个酮基，两个酯羰基，两个烯属 季碳）。两个高场质子信号（S H〇.97与δΗ1.98)的偶合常数为4.3Hz，是存在环丙烷结构的证 据；质子信号 SH2.59(lH，d，J = 4.2,3.8Hz，H-6)，2.48(lH，dd，J = 4.2,3.7Hz，H-7)及相应的 碳信号δe56.7 (C-6)与55.6 (C-7)表明该化合物含有环氧丙基结构。此外，通过核磁数据可 知该化合物还含有具有一个甲基侧链的α，β-不饱和七元内酯环[6( 16.06((1，1=12.9他，!1-l)，5.88(d，J=12.9Hz，H-2)，4.35(qd，J = 6.5,4.4Hz，H-4)，2.34(dd，J = 4.4,3.8Hz，H-5)， 1.27(3H，d，J=6.7Hz，H-28);Sc150.2(C-l)，119.6(C-2)，168.5(C-3)，73.5(C-4)，52.8(C-5)，37.0(010)，18.8(028)]和乙酰氧基[5[ 12.05(8，!1-1613,3!0;3。170.2((：-16&)，22.3((：-leWLHMBC谱中，H-16(5.32)与C-16a(S c170.2)的相关性表明乙酰氧基与C-160c77.1)位 相连。通过N0ESY谱数据解析H-4 (δΗ 4.25)、H3-28 (δΗ1.27)与H-5 (δΗ2.34)及H-6 (δΗ2.59)的 关系可以说明28-甲基相对立体构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相 关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ΕΟ)试验确定，理论 值与实验值基本一致。
[0021]该化合物化学式及碳原子编号如下：
[0022]
[0023] 实施例2:药理作用
[0024]本实施例使用通过获取BALB/C小鼠血小板抗体，接种到豚鼠身上，获取豚鼠抗小 鼠血小板抗体(APS)，将APS腹腔注射BALB/C小鼠建立免疫性血小板减少性紫癜动物模型， 观察药物使血小板计数上升、脾脏系数减少、骨髓成熟巨核细胞增多等方面的抗免疫性血 小板减少性紫癜作用。
[0025] 1、材料与方法
[0026] 1.1动物
[0027] BALB/C小鼠，体重18~23g，雌雄各半，SPF级，购自广东省医学动物实验中心；豚 鼠，雌性，体重350g，普通级，购自广东省医学动物实验中心。
[0028] 1.2试剂与样品
[0029] 二巯丁二酸购自中国药品生物制品检定所。化合物（I)自制，制备方法见实施例1。 弗氏不完全佐剂(北京鼎囯生物技术有限公司，DH-1341-l)，EDTA-Na2(天津巴斯夫化工有 限公司，分析纯），乌来糖(广东光华科技股份有限公司，分析纯），草酸氨(广东光华科技股 份有限公司，分析纯），泼尼松（西北第二合成制药厂，药用规格），瑞士染色试剂(北京博润 莱特科技有限公司）。
[0030] 1.3仪器
[0031]全自动血液分析仪(法囯，ABXPENTRA60)，电子天平(赛多利斯科学仪器(北京）有 限公司，BSA1245)，恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司，HA-4)，离心沉淀机(上海亚荣生化 仪器厂，80-2)，电热恒温干燥箱(广州市康恒仪器有限公司，101-A)，显微镜(尼康仪器有限 公司，NikoneclipseelOO) 〇
[0032] 1.4豚鼠抗血小板抗血清的制备
[0033] 取健康的BALB/C小鼠摘眼球取血，静置半个小时，8000rpm/min离心10min，取上层 血清1500rpm/min离心15min，取上层血清900rpm/min离心10min，取上层血清3000rpm/min 离心10min，弃去血清，得底部沉淀血小板，加入1 %草酸氨lmL，静置5min，3000rpm/min离心 lOmin，弃去上层液体，底部血小板用生理盐水洗涤三次，用生理盐水稀释到浓度为1~2 X 109/L，分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按1:1混合成弗氏完全佐剂血小板抗原混合 物与不弗氏完全佐剂血小板抗原混合物，备用；取健康豚鼠10只，于第1周注射弗氏完全佐 剂血小板抗原混合物于其四肢、腹股抅、背部、皮下，每处注射1〇〇此，于第2、3、4周注射同剂 量的不弗氏完全佐剂血小板抗原混合物。第4周末用20%乌拉坦2mL腹腔视射麻醉豚鼠，心 脏取血，1500rpm/min离心10min，取上层血清，余下全血继续3000rpm/min离心10min，合并 两次所得血清，得豚鼠抗小鼠血小板血清APS，-20°C保存，备用。自制直径9cm琼脂糖平板， 用打孔器打成梅花形孔，中间孔滴加血小板悬液(500 X 109/L)，周围孔加1:2、1:4、1:8、1: 16、1:32、1:64不同效价的豚鼠抗小鼠血小板血清。37°(：温箱孵育241 1，观察沉淀弧，检测抗 血清效价。
[0034] 1.5小鼠分组及模型制备
[0035] 小鼠随机分为6组，每组12只，分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照组(强的 松龙组，2.25mg · kg-4和二疏丁二酸组（120mg · kg-1化合物（I)组（120mg · kg-Ο、二疏丁 二酸与化合物（I)组合物组【60mg · kg<二巯丁二酸+60mg · kg<化合物（I)】。取出-20°C保 存的APS，56°C水浴30min灭活补体，用生理盐水稀释到1:4的效价，小鼠进行腹腔注射。于0、 2、4、6、8、10d按照100yg/20g小鼠腹腔注入稀释的抗血清，每2d重复注射一次，以维持血小 板的持续降低。从第1次注射APS后，给药组按上述相应剂量腹腔注射给药，正常对照组与模 型对照组注射生理盐水。
[0036] 1.6血小板计数实验
[0037]第10天给药后2h，摘眼球取血，检测血小板计数。
[0038] 1.7脾脏系数测定实验
[0039 ]解剖取出肝脏，称重，计算脾脏系数。
[0040] 1.8巨核细胞的分类数测定实验
[0041] 剥离股骨，取出骨髓涂片，瑞士染色法染色，计算巨核细胞的分类数
[0042] 1.9统计学方法
[0043]实验数据用均数土标准差(X土s)表示，应用SPSS18.0版统计软件进行单因素方差 分析和t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
[0044] 2、实验结果
[0045] 2.1对免疫性血小板减少性紫癜模型小鼠血小板计数的影响
[0046]与正常对照组比较，模型对照组小鼠血小板计数明显降低(P<0.01);与模型对照 组比较，二巯丁二酸与化合物（I)组合物组和阳性对照组血小板计数显著升高(P<〇.01); 与模型对照组比较，二巯丁二酸组、化合物（I)组小鼠血小板计数升高(P<〇.05)。结果见表 1〇
[0047] 2.2对免疫性血小板减少性紫癜模型小鼠脾脏系数的影响
[0048]与正常对照组比，模型对照组小鼠的脾脏系数明显升高(P<0.01)。与模型对照组 比较，二巯丁二酸与化合物（I)组合物组和阳性对照组小鼠脾脏系数显著降低(P<〇.01); 与模型对照组比较，二巯丁二酸组、化合物（I)组小鼠脾脏系数显著降低(P<〇.05)。
[0049] 试验结果见表1。
[0050] 2.3对免疫性血小板减少性紫癜模型小鼠巨噬细胞的影响
[0051] 与正常对照组比较，模型对照组小鼠的成熟巨噬细胞数明显下降(P<0.01)。与模 型对照组比较，二巯丁二酸与化合物（I)组合物组和阳性对照组小鼠的成熟巨噬细胞数显 著升高(p<0.01);与模型对照组比较，二巯丁二酸组、化合物（I)组小鼠的成熟巨噬细胞数 升高(Ρ<0·05)。
[0052] 试验结果见表1。
[0053] 表1对免疫性血小板减少性紫癜模型小鼠血小板、脾脏系数及巨噬细胞的影响
[0054]
[0056] 紫癜是临床上常见的出血症状之一，是由于患者体内存在抗血小板抗体。目前囯 内外对于紫癜的治疗主要一线药物是激素类药物如强的松、可的松、泼尼松龙等，或是静脉 注射人免疫球蛋白和脾脏切除等。从药理学角度看，使用激素进行治疗主要通过抑制对血 小板的吞噬、抑制血小板抗体的生成。脾脏等免疫器官是产生血小板抗体的主要场所，通过 产生血小板抗体破坏吞噬血小板，继而激发补体系统，经过经典、非经典膝血管外破坏血小 板，导致皮下出血现象。但据临床统计，使用激素类药物治疗有复发率高，副作用多，疗程长 等缺点，患者需长期服药治疗。据统计，只有10~20%患者停药后没有复发现象。使用脾脏 切除治疗，对于难治性紫癜通是没有效果的，对于体质弱的患者，特别是高龄患者难以长期 大剂量接受激素类药物的冲击治疗。
[0057] 上述结果表明，二巯丁二酸、化合物（I)单独作用时，对免疫性血小板减少性紫癜 具有治疗作用;二巯丁二酸和化合物（I)联合作用时，对免疫性血小板减少性紫癜的治疗效 果显著提高，可以开发成治疗免疫性血小板减少性紫癜的药物。
[0058] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物（I)，2. -种二琉下二酸的药物组合物，其特征在于:包括二琉下二酸、如权利要求1所述的 化合物(I)和药学上可W接受的载体，制备成需要的剂型。3. 根据权利要求2所述的二琉下二酸的药物组合物，其特征在于:药学上可W接受的载 体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载 体或润滑剂。4. 根据权利要求2所述的二琉下二酸的药物组合物，其特征在于:所述剂型包括片剂、 胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射 剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。5. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于，包含W下操作步骤：（a)将贯 叶金丝桃粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油酸、乙 酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物； (b)步骤(a)中正下醇取物用大孔树脂除杂，先用25%乙醇洗脱8个柱体积，再用70%乙醇洗 脱12个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物；（C)步骤(b)中70%乙醇 洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1和15:1的二氯甲烧-甲醇梯 度洗脱得到4个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、 15:1和1:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键 合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为72%的甲醇水溶液等度洗脱，收集10~16个柱体积 洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物(I)。6. 根据权利要求5所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为D101型 大孔吸附树脂。7. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗免疫性血小板减少性紫齋的药物中的应用。8. 权利要求2~4任一所述的二琉下二酸的药物组合物在制备治疗免疫性血小板减少 性紫齋的药物中的应用。
【文档编号】C07J73/00GK106083988SQ201610473707
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】陈露
【申请人】陈露