本发明涉及土壤修复技术领域，尤其是针对农田土壤重金属低浓度污染处理的修复剂制备方法。
背景技术：
据不完全统计，中国受重金属污染耕地面积约2.0×107 hm2，占耕地总面积的20%左右，以中轻度污染为主。土壤中的重金属来源主要为酸性矿山释放、采矿冶炼业的废水废渣排放，其他来源有污灌和污泥滥用、农药和化肥的过度施用以及化石类燃料的不完全燃烧等。重金属在土壤中的形态影响其活性、生物有效性和迁移特性，重金属的有些形态可以被植物吸收，经过食物链最终进入人体，进而危及人类健康。
目前，修复土壤重金属污染主要有两种方式：
一种是采用改变土壤中重金属的存在状态，降低重金属在其土壤环境中的可迁移性以及可被生物吸收利用的能力。这种方式采取的修复技术有固定化/稳定化技术和玻璃化技术；
另一种则是利用生物或工程技术方法去除土壤环境中的重金属，主要修复技术有土壤淋洗/萃取技术、电动修复技术、热解吸技术以及植物修复技术等。
工业场地因为重金属污染的范围广并且其工业用途等特性，多采用大规模工程技术方法进行修复，投入资金多，工程规模大。
相比较而言，农田土壤因考虑其用途和实际收支平衡关系，较少采用大规模工程投入进行重金属修复，多采用原位钝化（固定化或稳定化）、植物修复或农业生态修复技术等方式进行修复。由于处理成本低廉、效果快速、操作简单和不影响农作物生产等优点。
蛭石（Vermiculite）是一种天然、无毒的矿物质。四面体中一般有1/3-1/2的Si4+被Al3+置换，而带负电荷。另外，蛭石颗粒含有大量的硅（铝）羟基集团，有利于络合吸附重金属离子。因此，蛭石是良好的填好土壤修复剂。
土壤中含有丰富的微生物，可有效增加土壤微生物种群的数量和改善土壤微生物种群的结构。利用生物体系制备的生物重金属修复剂具有高效、价廉的特点，与传统的处理方法相比，微生物菌剂具有成本低，处理痕量离子时效果好，且易再生等优点化学药剂用量小（为化学法的1/2~1/10）；对污染环境适应性强，稳定性好；最大的优点是在修复过程中，微生物能不断增殖，生物质去除金属离子的量随生物质的量的增加而增加。这些微生物的生命代谢活动能降低环境中重金属元素的浓度或使其完全无害。这是因为，微生物可以通过改变土壤中重金属的化学或物理特性，来影响重金属在土壤中的迁移与转化，进而降低重金属危害。微生物可以对土壤中重金属进行固定、移动或转化降解，改变它们在土壤中的环境化学行为，可促进有毒、有害物质解毒或降低毒性，从而达到生物修复的目的。比起常规的物理和化学修复方法，其最大优点是经济高效且不会形成二次污染，可谓是潜在环境“天然排毒”。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种重金属污染土壤修复剂制备方法，该修复剂能广泛用于治理重金属污染农田土壤。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种重金属污染土壤修复剂制备方法，该修复剂为微生物和膨胀蛭石的组合，膨胀蛭石经无菌处理后，将膨胀蛭石与菌悬液以质量比1:2~1:4的比例混合在一起，避光进行吸附培养，1~3小时后吸附平衡按成微生物的固定化；所述菌悬液是根据微生物对营养、酸碱度、氧等条件不同，而供给它适宜的培养条件，或加入抑制剂造成只利于此微生物生长，抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰其他不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或平板划线法分离、纯化微生物，直到得到纯菌株，将该纯化的菌株接种至培养液中培养1~3天即可，菌悬液存放于4℃冰箱中。
上述方案中，所述微生物采用综合废水生化处理活性污泥所培养的细菌，经转接斜面和液体培养基中活化后，放在冰箱中4℃保存。
上述方案中，所述微生物的驯化、分离和纯化包括如下步骤：
（1）土悬液制备：
取泥样10g于装有90mL无菌水的锥形瓶中，用振荡器振荡，摇匀后将土悬液一次稀释到10-3、10-4、10-5备用；
（2）水样稀释：
取待修复的土壤反复淋洗三遍，将淋洗所得的污水1mL装入49mL无菌水的三角瓶中，混匀后将水样依次稀释到10-3、10-4、10-5备用；
（3）分离培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基中加入不同浓度的镉、铜作为筛选耐镉、铜细菌培养基；
（4）分离纯化
在培养皿中倒入牛肉膏蛋白胨培养基，冷却凝固，去0.1mL的10-3、10-4、10-5浓度的土样悬液及水样稀释液用涂布法涂匀在平板上，30℃培养5~7天，然后挑选出培养皿上生长的单个菌落，在永阳的培养基上划线，反复纯化多次，将纯化的菌种放入4℃冰箱中保存备用；
（5）细菌的驯化
在固体培养基中加入镉、铜标准溶液，使培养基镍离子的含量为10mg/L，并将所筛选出的菌株接种到镉、铜离子的含量分别为20mg/L的培养基中，再次培养驯化，将驯化出的菌株一次接种到浓度为30、40、50、60、70、80、90、100mg/L的筛选培养基中，观察期生长情况，逐步淘汰耐镉、铜能力差的菌株，并记录不同细菌的最高耐受浓度，筛选出耐受力最高的菌株。
上述方案中，所述液体培养基由牛肉膏2~4g，蛋白胨4.5~5.5g，NaCl 2~3g，蒸馏水1000mL混合制成。
上述方案中，所述固体培养基由牛肉膏2~4g，蛋白胨4.5~5.5g ，NaCl 2~3g，琼脂10~20g，蒸馏水10~20g混合制成；而筛选培养基由牛肉膏2~4g，蛋白胨4.5~5.5g，NaCl2~3g，蒸馏水1000mL，加入一定浓度含镉、铜溶液混合制成。
上述方案中，所述微生物是电镀废水生化处理活性污泥中筛选培养的芽孢杆菌。
本发明的制备方法简单，投资成本低，所得的重金属污染土壤修复剂利用了膨胀蛭石的较大比表面积，又利用微生物分泌碱性物质提高土壤pH固定钝化吸附在蛭石表面的重金属，同时又利用膨胀蛭石的固定包埋保护作用，有效屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对修复菌的恶性竞争、吞噬和毒害，有效提高微生物对重金属的固定化作用。具有操作维护简便、修复效率高、投资和运行费用低等优点，尤其适用于低浓度重金属污染的农田土壤修复。
具体实施方式：
本发明提供一种重金属污染土壤修复剂制备方法，该修复剂为微生物和膨胀蛭石的组合，膨胀蛭石经无菌处理后，将膨胀蛭石与菌悬液以质量比1:2~1:4的比例混合在一起，避光进行吸附培养，1~3小时后吸附平衡按成微生物的固定化。将该修复剂用于治理重金属污染农田土壤，利用膨胀蛭石的较大比表面积，又利用微生物分泌碱性物质提高土壤pH固定钝化吸附在蛭石表面的重金属，同时又利用膨胀蛭石的固定包埋保护作用，有效屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对修复菌的恶性竞争、吞噬和毒害，有效提高微生物对重金属的固定化作用；具有操作维护简便、修复效率高、投资和运行费用低等优点，尤其适用于低浓度重金属污染的农田土壤。
实施例：
1.菌种来源：
采用某电镀工业园区综合废水生化处理活性污泥所培养的细菌，经转接斜面和液体培养基中活化后，放在冰箱中4℃保存。
2. 培养基：
（1）液体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 2.5g，蒸馏水1000mL。
（2）固体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g ，NaCl 2.5g，琼脂15g，蒸馏水15g。
（3）筛选培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 2.5g，蒸馏水1000mL，加入一定浓度含镉、铜溶液。
3. 菌种的驯化、分离和纯化：
（1）土悬液制备：
取泥样10g于装有90mL无菌水的锥形瓶中，用振荡器振荡，摇匀后将土悬液一次稀释到10-3、10-4、10-5备用。
（2）水样稀释：
取待修复的土壤反复淋洗三遍，将淋洗所得的污水1mL装入49mL无菌水的三角瓶中，混匀后将水样依次稀释到10-3、10-4、10-5备用。
（3）分离培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基中加入不同浓度的镉、铜作为筛选耐镉、铜细菌培养基。
（4）分离纯化：
在培养皿中倒入牛肉膏蛋白胨培养基，冷却凝固，去0.1mL的10-3、10-4、10-5浓度的土样悬液及水样稀释液用涂布法涂匀在平板上，30℃培养5~7天，然后挑选出培养皿上生长的单个菌落，在永阳的培养基上划线，反复纯化多次，将纯化的菌种放入4℃冰箱中保存备用。
（5）细菌的驯化：
在固体培养基中加入镉、铜标准溶液，使培养基镍离子的含量为10mg/L，并将所筛选出的菌株接种到镉、铜离子的含量分别为20mg/L的培养基中，再次培养驯化，将驯化出的菌株一次接种到浓度为30、40、50、60、70、80、90、100mg/L的筛选培养基中，观察期生长情况，逐步淘汰耐镉、铜能力差的菌株，并记录不同细菌的最高耐受浓度，筛选出耐受力最高的菌株。
3.菌液的配置：
根据微生物对营养、酸碱度、氧等条件不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此微生物生长，抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰其他不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或平板划线法分离、纯化微生物，直到得到纯菌株。将该纯化的菌株接种至培养液中培养1~3天，将其置于4℃冰箱备用，把此种培养液作为修复试验的接种菌液。
4．微生物固定化：
膨胀蛭石经无菌处理后，将其与菌悬液以质量比1:3的比例混合在一起，避光进行吸附培养，2小时后吸附平衡按成微生物的固定化。
本发明与现有技术比对，有益效果如下：
经研究发现电镀废水生化处理活性污泥中筛选培养的微生物主要为芽孢杆菌。微生物对重金属的作用可以总结为以下几点：
1. 微生物对重金属的生物积累和生物吸着：
由于微生物对重金属具有很强的亲合吸附性能，有毒金属离子可以结合到胞外基质上或被轻度螯合在生物的多聚物上或沉积在细胞的不同部位，来降低重金属危害。
微生物对重金属的生物积累和生物吸着主要表现为胞外络合、沉淀以及胞内积累等三种形式：如动胶菌、蓝细菌、硫酸盐还原菌以及某些藻类，能够产生胞外聚合物如多糖、糖蛋白等具有大量的阴离子基团，与重金属离子形成络合物来吸着环境中的多种重金属；芽孢杆菌对镉(Cd)的富集可以达到其生物量(干重)的21.4%，对铅(Pb)的富集可高达61%；柠檬酸细菌属的细菌具有一种抗钴(Co)的酸性磷酸酯酶，它的分解物质2-磷酸甘油能够与钴形成沉淀；重金属进入微生物细胞后，可通过“区域化作用”，分配于细胞内的不同部位，细胞通过合成金属硫蛋白与金属离子结合形成无毒或低毒络合物。
2. 微生物对重金属的生物转化作用：
微生物对重金属进行生物转化的作用机理主要包括，微生物对重金属的生物氧化和还原以及重金属的有机络合配位降解，通过改变其毒性或稳定性，达到降低重金属危害的效果。
（1）多种微生物能够利用铬酸盐的还原特性，对重金属污染土壤进行修复。如产碱菌属、芽孢杆菌属、棒杆菌属、肠杆菌属、假单胞菌属和微球菌属的微生物可以使铬酸盐和重铬酸盐还原，通过将高毒性的6价铬(Cr6+)还原为低毒性的3价铬(Cr3+)，来降低其危害。
（2）微生物也可通过改变重金属的稳定性，对重金属污染土壤进行修复。如硫铁杆菌类细菌能氧化铜(Cu)、砷(As)、钼(Mo)和铁(Fe)等，假单孢杆菌属能使砷(As)、铁(Fe)和锰(Mn)等发生生物氧化，降低这些重金属元素的活性；硫还原细菌可通过两种途径将硫酸盐还原成硫化物，一是在呼吸过程中硫酸盐作为电子受体被还原，二是在同化过程中利用硫酸盐合成氨基酸，如胱氨酸和蛋氨酸，再通过脱硫作用使硫离子(S2-)分泌于体外，与重金属钴(Co)形成沉淀，这一过程在重金属污染治理方面有重要的意义。
3、微生物对重金属元素的溶解和沉淀作用：
土壤中的微生物能够利用有效的营养和能源，在土壤滤沥过程中通过分泌有机酸（如甲酸、乙酸、丙酸和丁酸等）络合并溶解重金属。金属价态改变后，金属的络合能力也发生变化，一些微生物的分泌物与金属离子发生络合作用，从而降低重金属毒性、溶解降解土壤重金属。
膨胀蛭石既可固定稳定环境中的污染物、吸附微生物代谢产生有毒物质，又可通过表面交联、配位、成键、插层等反应实现对微生物的固定化。微生物经过固定后，其稳定性和活性、氧与底物传质速率等反应特性均有较大的提高。此外。还具有一定的电子输送能力，其特殊的晶体结构可有效屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对降解菌的恶性竞争、吞噬和毒害，保护修复菌细胞，可有效提高固定化的微生物对重金属的修复能力。同时利用膨胀蛭石较大的比表面积和较强的吸附锁定能力，可以在其表面聚集更多的污染物，从而提高固定在蛭石上的微生物对重金属的生物钝化作用，缩短周期。土壤中的重金属首先由膨胀蛭石捕获，再在附着在蛭膨胀石表面微生物的作用下发生络合、沉淀，从而被固定化在修复材料中。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换与比例调整，而不脱离本技术案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。