一种纳米纤维素生物打印凝胶油墨的制备方法与流程

本发明涉及一种凝胶油墨的制备方法，具体涉及一种超纯纳米纤维素生物打印凝胶油墨的制备方法，属于生物、医药新材料制造
技术领域：
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背景技术：
：纳米纤维素在制备过程中易于形成水凝胶，其高度水化的三维网络结构能够很好的模拟人体器官组织中的细胞外基质，从而为细胞黏附、生长、繁殖提供良好的3d微环境。因此，目前国内外在3d打印纤维素基材料的开发利用，主要集中在人造器官、组织工程、伤口修复等生物医学应用领域。国外已经商业化的基于纳米纤维素的生物打印油墨，主要有瑞典的纳米纤维素-海藻酸钠复合油墨（cellink®）。cellink®油墨是通过纳米纤维素与海藻酸钠按照一定比例混合制得的凝胶油墨。尽管cellink®油墨能够流畅地进行3d打印不同的生物医学结构，但基于该复合油墨的3d打印在生物医学新材料的应用中仍然存在一系列的生物相容性缺陷和不足：①纳米纤维和海藻酸钠在制备过程中潜在的致热致敏杂质（内毒素，（1,3）-beta-d-葡聚糖）未能按照相关药典或医学临床阈值加以严格控制；海藻酸钠和纳米纤维素自身均为生物惰性，没有细胞黏附性且不能直接促进细胞生长繁殖，从而导致细胞增殖缓慢；③打印结构机械强度低或与天然组织强度不匹配，随着细胞培养或体内移植时间推移，交联的钙离子流失，打印结构强度随之削弱；④由于纤维素在人体内难以进行有效的生物降解，导致打印支架结构生物降解速率与新组织形成不匹配；⑤打印较大较厚的结构中细胞难以与外界进行有效的养分和代谢废物交换，从而导致细胞活力降低；⑥打印过程中使用的交联剂（例如钙离子）对细胞活力造成损伤。技术实现要素：为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有优良的生物相容性，无细胞毒性，可生物降解的纳米纤维素生物打印凝胶油墨的制备方法。为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：一种超纯纳米纤维素生物打印凝胶油墨的制备方法，包括以下步骤：s1、采用高压灭菌和碱/酸顺序抽提预处理纸浆纤维，再用tempo催化氧化结合高压均质处理，制得超纯纳米纤维素水凝胶；s2、生物偶联灭菌后的木糖葡聚糖和细胞黏附因子，制得生物活性木糖葡聚糖；s3、将生物活性木糖葡聚糖溶于无菌水中，再加入纳米纤维素水凝胶、灭菌后的凝胶增强剂，混合均匀后，制得超纯纳米纤维素生物打印凝胶油墨。上述步骤s1中的高压灭菌和碱/酸顺序抽提预处理，包括以下步骤：a1、将漂白后的纸浆纤维搅拌分散于无菌水，加入氢氧化钠、过氧化氢，搅拌，高压灭菌后，洗涤至中性；a2、再搅拌分散于无菌水，加入盐酸，搅拌，高压灭菌后，洗涤至中性。进一步的，上述步骤a1中纸浆纤维为100g，无菌水为3l，氢氧化钠5-10g、过氧化氢2-5g，灭菌时间为15-60min；步骤a2中无菌水为3l，盐酸10-30g，灭菌时间为15-60min。上述步骤s1中的tempo催化氧化结合高压均质处理，包括以下步骤：b1、在预处理后的纸浆纤维中，加入tempo，溴化钠，次氯酸钠，调节并保持ph至10.0-10.5，搅拌反应直至体系ph稳定；b2、过滤并使用无菌水清洗至绿叶滤液电导率低于5μs/cm；b3、清洗后的纸浆纤维分散在无菌水中，分别以200-600bar和800-1800bar的压力通过高压均质，制得超纯纳米纤维素水凝胶。进一步的，上述纳米纤维素水凝胶的浓度>3%，内毒素含量低于5eu/g,(1,3）-beta-d-葡聚糖含量低于10μg/g)。进一步的，上述步骤b1中的tempo为0.5-1g，溴化钠为2-6g，次氯酸钠的浓度为15%，质量为300-600g；步骤b2中的无菌水为2l。上述步骤s2中木糖葡聚糖的灭菌为：将木糖葡聚糖溶于无菌水中，高压灭菌；步骤s3中凝胶增强剂的灭菌为：将凝胶增强剂溶于无菌水中，高压灭菌。上述步骤s2中的生物偶联，包括以下步骤：c1、将灭菌后的木糖葡聚糖沉淀于乙醇中，过滤清洗，冷冻干燥，制得纯化木糖葡聚糖；c2、纯化木糖葡聚糖溶于无菌水中，加入细胞黏附因子，室温搅拌反应，经透析袋，无菌水流水透析后，冷冻干燥，制得生物活性木糖葡聚糖。进一步的，上述步骤c1中的乙醇为3l；步骤c2中的无菌水为1l，细胞黏附因子为1-3g，反应时间为6-24h，透析袋为3.5k，透析时间为12-48h。上述步骤s3中的生物活性木糖葡聚糖为0.5-2g，无菌水10-50ml，纳米纤维素水凝胶100g，凝胶增强剂0.02-1.0g。本发明的有益之处在于：本发明的一种超纯纳米纤维素生物打印凝胶油墨的制备方法，所制备的生物打印凝胶油墨具有优良的生物相容性，无细胞毒性，可生物降解；其高度水化的三维立体网络结构，能够最大程度上模拟还原真实的细胞外基质微环境及结构，为细胞黏附、生长、繁殖、分化提供理想的微环境。通过原料的预处理，去除原料中致热、致敏杂质（内毒素，（1,3）-beta-d-葡聚糖），保证其含量远低于药典规定以及医学临床阈值，使得产品可应用于组织工程、生物支架构建、3d细胞培养、药物筛选、3d打印等领域。本发明解决了其他纳米纤维素凝胶油墨中致热致敏杂质无法控制的不足，解决了其他纳米纤维素凝胶油墨生物惰性的不足，解决了其他生物油墨力学性能不足，且需要钙离子交联从而影响细胞活性的不足，具有很强的实用性和广泛的适用性。附图说明图1为使用本发明制备超纯纳米纤维素凝胶油墨进行生物打印的生物支架结构图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。一种超纯纳米纤维素生物打印凝胶油墨的制备方法，包括以下步骤：（1）将漂白纸浆纤维100克在3升无菌水中搅拌分散均匀，加入10克氢氧化钠，2克过氧化氢，搅拌均匀，高压灭菌60分钟；将木糖葡聚糖10克溶解在1升无菌水中，高压灭菌30分钟；将凝胶增强剂5克溶解于100毫升无菌水中，高压灭菌20分钟。（2）将步骤(1)中的纸浆纤维用无菌水过滤清洗至ph中性。（3）将步骤（2）中清洗干净的纸浆纤维分散在3升无菌水中，加入30克盐酸，搅拌均匀，高压灭菌60分钟。（4）将步骤(3)中的纸浆纤维用无菌水过滤清洗至ph中性。（5）将步骤（4）中清洗干净的纸浆纤维分散在5升无菌水中搅拌，采用tempo催化氧化结合高压均质处理，制取高纯、高浓（>3%）纳米纤维素水凝胶。（加入1克tempo（2,2,6,6-四甲基哌啶氧基或2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基），5克溴化钠，500克15%次氯酸钠，调节并保持ph至10.5，室温下搅拌反应直至体系ph不在改变；过滤并使用无菌水清洗直至绿叶电导率低于5μs/cm。将步骤（4）中清洗干净的纸浆纤维分散在2升无菌水中搅拌均匀，分别以500bar和1500bar的压力通过高压均质，制取高纯、高浓纳米纤维素水凝胶。）（6）将步骤（1）中灭菌的木糖葡聚糖溶液沉淀于3升乙醇中，过滤清洗，冷冻干燥，制得纯化木糖葡聚糖。（7）将步骤（6）中的纯化木糖葡聚糖溶解在1升无菌水中，加入3克细胞黏附因子(rgd)，室温搅拌反应24小时，3.5k透析袋，无菌水流水透析24小时，冷冻干燥，制得生物活性木糖葡聚糖。（8）将步骤（7）中生物活性木糖葡聚糖1克溶解在50毫升无菌水中，加入100克步骤（5）中制得的纳米纤维素水凝胶中，加入步骤（1）中制得的凝胶增强剂溶液0.5克，混合均匀，制得一种超纯纳米纤维素生物打印凝胶油墨成品。内毒素含量（eu/g）(1,3）-beta-d-葡聚糖(μg/g)生物打印流畅性及打印结构稳定性实施例2.03.5流畅，稳定无塌陷表1上表1为本发明的实施例所制备的超纯纳米纤维素生物打印凝胶油墨中致热致敏杂质含量，以及使用该油墨进行生物打印生物支架的打印性能。由表1可知，该油墨中内毒素和(1,3）-beta-d-葡聚糖含量远低于欧洲药典和临床阈值。如图1所示，为使用本发明实施例的超纯纳米纤维素生物打印凝胶油墨打印的生物支架结构图，可看出，本发明公开的油墨可用于生物打印，流畅地打印生物支架结构，打印结构分辨率高，打印结构无需使用钙离子进行交联增强。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。当前第1页12