具有改进的稳定性和快速发光的亲水高量子产率吖啶酯的制作方法
【专利说明】具有改进的稳定性和快速发光的亲水高量子产率吖啶酯
[0001] 1.对相关申请的交叉引用 本申请要求2013年7月8日提交的美国临时申请序列号No. 61/843, 528的优先权， 其全文经此引用并入本文。
[0002] 2.发明领域 本发明涉及具有提高的光输出、改进的稳定性、快速发光和低非特异性结合的亲水、高 量子产率化学发光吖啶鑰化合物。这些化合物因其提高的量子产率和亲水性质而可用于改 进检测灵敏度。这些化合物的改进的稳定性有助于延长使用这些化合物的试剂的贮存寿命 以及使检测性能随时间的变化最小化。它们的提高的发射动力学尤其在自动化分析仪中的 检测中还能实现更快的光测量。
[0003] 3.发明背景 化学发光的吖啶酯（AE)是已广泛用于免疫测定和核酸测定的极其有用的标记物。 Pringle, M. J. JoyraaJ ο/1 第忍卷，第 105-122 页（1999)的 综述概括了这类化学发光化合物过去和当前的发展。
[0004] McCapra, F.等人在 TfeiraAeiimw Zeii.第丈?卷，第 3167-3172 页（1964)中和 Rahut等人在J (5/芯CAe?第卷，第3587-3592页（1965)中公开了可通过碱性过氧 化物触发来自吖啶鑰盐的酯的化学发光。自这些开创性研究以来，由于它们作为标记物的 效用，对吖啶鐵化合物的兴趣已经增加。Simpson, J.S.A.等人，Tfe tore,第276卷，第 646-647页（1979)公开了吖啶酯9-羧基苯基-N-甲基吖啶鑰溴化物在免疫测定中的应用。 但是，这种吖啶酯相当不稳定，由此限制其商业应用。这种不稳定性来源于酚和吖啶鑰环之 间的9-羧基苯基酯连接基的水解。
[0005] 已经描述了用于提高吖啶鐵化合物的稳定性的不同策略。Law等人，JoyraaJ ο/1 組第 4卷，第 88-89 页（1989)将两个甲基引入 吖啶酯部分的侧面以稳定这种连接基。发现所得空间稳定的吖啶酯，DME-NHS [10-甲基 吖啶-9-甲酸2'，6'-二甲基-4'-(N-琥珀酰亚胺氧基羰基）苯基酯]具有与不含这两个 甲基的吖啶酯相同的光输出。前一化合物在结合到免疫球蛋白上时的稳定性极优并且甚至 在37°C下在pH 7下一周后也没有表现出化学发光活性的损失。相反，未取代的吖啶酯在 经受相同处理时仅保留其活性的10%。美国专利No. 4, 918, 192和5, 110. 932描述了 DMAE 及其应用。
[0006] 授予Law等人的美国专利No. 5, 656, 426公开了 DMAE的一种亲水形式，被称作 NSP-DMAE-NHS酯，其中N-甲基基团已被N-磺丙基（NSP)所替代。下面图解这两种化合物 的结构和吖啶鑰环的编号系统。
[0007] Natrajan等人在美国专利No. 6, 664, 043 B2中公开了具有连接到 酚上的亲水改性剂的NSP-DMAE衍生物。在上文中图解了 一种这样的化合物， NSP-DMAE-HEG-Glutarate-NHS (缩写为HEG-AE)的结构。在这种化合物中，二氨基六（乙 二醇）（diamino hexa(ethylene) glycol，二氨基-HEG)部分连接到酸上以提高该吖啶酯 的水溶性。戊二酸酯部分附加到HEG的末端并转化成NHS酯以便能标记各种分子。
[0008] Kinkel 等人, Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 第 4卷， 第 136-139 页（1989)和 Mattingly, Journal of Bioluminescence and 〇￡7??_/知^?_//76'6^6'/^6'，第^卷，第107-114页（1991)和美国专利1'1〇.5,468,646描述了不 同的一类稳定的化学发光吖啶鑰化合物。在这类化合物中，酚酯连接基被磺酰胺部分所替 代，这据报道提供水解稳定性而不损害光输出。在吖啶酯中，酚是"离去基"，而在吖啶鑰磺 酰胺中，磺酰胺是与碱性过氧化物的化学发光反应过程中的"离去基"。
[0009] 通常通过碱性过氧化物触发来自吖啶鑰化合物的发光。总光输出--也可被称作 化学发光量子产率，是该化学反应导致形成激发态吖啶酮的效率和激发态吖啶酮的荧光量 子产率的组合。
[0010] 最近，Natrajan等人在美国专利No. 7, 309, 615 B2 (其公开内容经此引用并入本 文）中描述了在吖啶鑰环的C2和/或C7上含有亲水烷氧基（0R*)的亲水、高量子产率吖啶 鑰化合物，其中R*是包含磺丙基部分或乙二醇部分或其组合的基团。来自此类化合物的提 高的光输出和它们的亲水性质使它们可用于改进免疫测定的灵敏度。下面图解一种这样的 化合物 NSP-2, 7-(0MHEG)2-DMAE-AC-NHS (缩写为 HQYAE)的结构。
[0011] 4.发明概述 已经令人惊讶地发现，在吖啶鑰环的C2和/或C7上具有-OG形式的给电子官能团的 亲水、高量子产率化学发光吖啶酯提供提高的光输出、改进的稳定性、快速发光和/或在检 测中的低非特异性结合，其中G代表支链亲水的取代基。
[0012] 在本发明的一个方面中，提供了亲水、高量子产率吖啶酯，其具有式（I)的结构：
其中，R1是甲基或磺丙基；G是支链基团，其在每次出现时独立地选自：
其中R2、R3、R4、R5、iaP R7在每次出现时独立地为甲基或基团-(CH2CH2O)bCH 3,其中是 1至5的整数；且R12是用于使吖啶鑰化合物缀合到被分析物、被分析物类似物或被分析物 的结合分子上的亲电子或亲核基团。
[0013] 在根据式（I)的一些实施方案中，G在一处或在两处出现时是基团：
其中私和R3在每次出现时独立地为甲基或基团-(CH2CH2O) bCH3,其中是1至5的整 数；且特别地，G可以在一处或在两处出现时是基团：
;或在另一实施方案中G可以在一处或在两处出现时是基团：
[0014] 在一个相关实施方案中，G在一处或在两处出现时是基团：
[0015] 在根据式（I)的其它实施方案中，G在一处或在两处出现时代表基团：
其中HRjP R7在每次出现时独立地为甲基或基团-(CH2CH2O)bCH 3,其中是1至5 的整数。在根据这一实施方案的一个变体中，R4-R7可代表甲基，以使G在一处或在两处出 现时是基团：
[0016] 在根据式（I)的一个实施方案中，G在一处或在两处出现时是基团：
[0017] 在根据式（I)的吖啶酯中，R12可以例如选自： (1) -OH ； (2) -O-N-琥珀酰亚胺基； (3) -NH- (CH2) 5-C (0) -O-N-琥珀酰亚胺基； (4) -NH- (CH2) 5-C00H ； (5) -NH- (C2H4O) "-C2H4NH-C (0) - (CH2) 3-C (0) -O-N-琥珀酰亚胺基，其中/? = 1 至 5; (6) -NH- (C2H4O) "-C2H4NH-C (0) - (CH2) 3-C00H，其中 λ = 1 至 5 ; (7) -NH-(C2H4O)b-C 2H4NH2，其中 /? = 1 至 5 ;和 (8) -NH-R-NHR，其中R独立地为氢、烷基、烯基、炔基或芳烷基；其中R任选包含最多20 个杂原子。
[0018] 在各种不例性实施方案中，R12是_〇Η，或R 12是基团： -NH-(C2H4O)b-C2H4NH 2,其中刀=1 至 5， 或Ri2是基团： -NH- (C2H4O) "-C2H4NH-C (0) - (CH2) 3-C (0) -0-R' '，其中 /?= 1 至5;且其中 R'' 是氢 或-N-琥珀酰亚胺基。
[0019] 一种根据式（I)的吖啶酯具有下列结构：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物缀合到被分析物、被分析物类似物或被分析物的结合 分子上的亲电子或亲核基团。
[0020] 另一根据式（I)的吖啶酯具有下列结构：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物缀合到被分析物、被分析物类似物或被分析物的结合 分子上的亲电子或亲核基团。
[0021] 又一根据式（I)的吖啶酯具有下列结构：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物缀合到被分析物、被分析物类似物或被分析物的结合 分子上的亲电子或亲核基团。
[0022] 另一根据式（I)的吖啶酯具有下列结构：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物缀合到被分析物、被分析物类似物或被分析物的结合 分子上的亲电子或亲核基团。
[0023] 再一根据式（I)的吖啶酯具有下列结构：
其中R12是用于使吖啶鑰化合物缀合到被分析物、被分析物类似物或被分析物的结合 分子上的亲电子或亲核基团。
[0024] 在根据式（I)的吖啶酯的一个示例性实施方案中，R12代表-OH。
[0025] 在本发明的另一方面中，提供了一种用于检测或量化被分析物的测定法，其包括 步骤：(a)提供一种缀合物，其包含：（i)被分析物的特异性结合分子；和（ii)根据式（I) 的亲水、高量子产率和快速发光的吖啶酯；(b)提供具有固定在其上的被分析物的第二特 异性结合分子的固体载体；(C)混合所述缀合物、所述固相和怀疑含有所述被分析物的样 品以形成结合复合物；（d)分离捕获在所述固体载体上的结合复合物；（e)通过添加化学 发光触发剂触发来自步骤（d)的结合复合物的化学发光；（f)用光度计测量发光量；和（g) 通过将来自反应混合物的发光量与将发光量与被分析物的已知浓度相关联的标准剂量响 应曲线比较，来检测被分析物的存在或计算被分析物的浓度。
[0026] 在一个相关方面中，提供了一种用于检测或量化被分析物的测定法，其包括步骤： (a)提供被分析物与根据式（I)的亲水、高量子产率和快速发光的吖啶酯的缀合物；(b) 提供固定有被分析物的特异性结合分子的固体载体；（C)混合所述缀合物、固体载体和怀 疑含有所述被分析物的样品以形成结合复合物；（d)分离捕获在所述固体载体上的结合复 合物；（e)通过添加化学发光触发剂触发来自步骤（d)的结合复合物的化学发光；(f)用 光度计测量光量；和（g)通过将反应混合物的发光量与将发光量与被分析物的已知浓度 相关联的标准剂量响应曲线比较，来检测被分析物的存在或计算被分析物的浓度。
[0027] 通过参考以下发明详述和所附权利要求书更清楚地理解本发明的这些和其它方 面。
[0028] 5.附图简述 图1图解了具有适用于制备蛋白质或其它含亲核官能团的分子的缀合物的亲电子 N-羟基琥珀酰亚胺基（NHS)官能团的B-AE的结构。
[0029] 图2图解了具有可用于使该吖啶鑰化合物与含亲电子官能团的分子缀合的亲核 六乙二醇胺（HEG-NH 2)官能团的B-AE结构。
[0030] 图3显示使用图2的B-AE制备的雌二醇缀合物(缩写为B-AE-E2)的结构。
[0031] 6.优选实施方案的描述 在口丨z陡鐵环的C2和/或C7上引入给电子官能团如0R*提尚相应的化学发光卩丨z陡鐵化 合物的量子产率。当该R*基团为亲水的，如磺丙基或甲氧基聚（乙二醇）时，相应的吖啶 鑰化合物不仅表现出提高的光输出，还表现出在免疫测定中降低的非特异性结合。这两种 性质共同导致免疫测定的灵敏度提高。
[0032] 本发明的主要目的是确认导致（a)与NSP-DMAE和衍生物以及HQYAE相比时更快 的发光；(b)尤其与HQYAE相比时改进的稳定性；（c)与HQYAE相当的高光输出和（d)与 HQYAE相当的低非特异性结合的吖啶鑰化合物的结构特征。
[0033] 根据本发明的亲水吖啶鑰化合物，缩写为B-AE (支链-吖啶酯)，不仅表现出提高 的光输出，还表现出改进的稳定性和更快的发光。稳定性是指吖啶鑰化合物的化学发光活 性。稳定性的提高因此表现为化学发光活性的提高的经时保持性。吖啶鑰化合物的提高的 稳定性是有用的，因为衍生自此类化合物的试剂较不可能表现出检测性能的经时劣化，此 外，可能延长衍生自此类化合物的试剂的贮存寿命，由此造成较少浪费。通常，衍生自吖啶 鑰化合物的检测试剂包括蛋白质或小分子的缀合物。该吖啶鑰化合物的第二种性质是更快 的发光，这意味着这些化合物与缺乏本发明的吖啶鑰化合物的独特结构特征的吖啶鑰化合 物相比在