(0· 54 克，1. 2毫摩尔）和碳酸铯（0. 2克，0. 06毫摩尔）在无水DMF (5毫升）中的混合物在氮气气 氛下在100°C下加热4-5小时。然后通过使用Phenomenex, C18 4.6 mm X 25 cm柱和10 -100% B (A =含0· 05% TFA的水，B =含0· 05% TFA的MeCN)在L 0毫升/分钟流速下 的30分钟梯度和在260纳米的UV检测的HPLC来分析小部分的反应混合物。观察到在Rt =26. 2分钟洗脱的产物并且其是主要组分。然后将该反应冷却到室温并在减压下浓缩。使 残留物在乙酸乙酯（75毫升）和水（50毫升）之间分相。分离乙酸乙酯层，经无水硫酸镁干 燥并在减压下浓缩。粗产物（〇. 45克)通过在硅胶上使用乙酸乙酯中的1%甲醇作为洗脱剂 的制备TLC来提纯。产量=64克（28 %);MALDI-T0F MS观察值973. 8。
[0094] d)化合物5f。化合物5d(64毫克，65. 7微摩尔）、蒸馏1，3-丙磺酸内酯（1.6克， 13. 1毫摩尔）和碳酸氢钠（110毫克，1. 3毫摩尔）的混合物在氮气气氛下在150°C下加热。 在2小时后，提取小部分，用甲醇稀释并通过使用Phenomenex, C18 4. 6 mm X 25 cm柱和 10 - 100% B (A =含 0· 05% TFA 的水，B =含 0· 05% TFA 的 MeCN)在 I. 0 毫升 / 分钟流 速下的30分钟梯度和在260纳米的UV检测的HPLC来分析。观察到在Rt = 20. 5分钟洗 脱的产物（>60%转化率)。将该反应冷却到室温并加入20毫升的1:1乙酸乙酯/己烷。在 简短声处理以分散胶状产物后，滗析溶剂并将产物5e在真空下干燥。
[0095] 使粗制吖啶酯5e悬浮在I N HCl (10毫升）中并在氮气气氛下回流2小时。如 上所述的HPLC分析显示完全转化成在17. 5分钟洗脱的产物5f。通过使用YMC，C18 30 X 300 mm柱和在20毫升/分钟的溶剂流速下的上述相同梯度和在260纳米的UV检测的 制备HPLC提纯产物。合并含产物的HPLC级分并在减压下浓缩。产量=12毫克（17 %); MALDI-TOF MS 观察值 1082.4。
[0096] e)化合物5g。化合物5f (12毫克，11. 1微摩尔）在无水DMF (1毫升）中的溶液 用二异丙基乙胺（4.0微升，22微摩尔)和TSTU (5毫克，16. 7微摩尔)处理。在室温下搅拌 该反应。在30分钟后，如（c)部分中所述的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 19. 5分钟 洗脱的NHS酯。将该反应逐滴添加到2, 2' -(亚乙二氧基）双（乙胺）（16微升，0· 11毫 摩尔）在无水DMF (1.0毫升）中的经搅拌溶液中。在1小时后，如（c)部分中所述的反应 混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 14. 7分钟洗脱的产物5g。通过如（d)部分中 所述的制备HPLC提纯产物。产量=15. 4毫克(定量）；MALDI-TOF MS观察值1212. 9。
[0097] f) B04-AE-NHS,化合物5i。化合物5g (15. 4毫克，12. 7微摩尔）在无水甲醇（2 毫升）中的溶液用二异丙基乙胺（11微升，63. 5微摩尔）和戊二酸酐（7. 2毫克，63. 5微摩 尔）处理。在室温下搅拌该反应。在30分钟后，如（c)部分中所述的HPLC分析显示完全 转化成在Rt = 16. 2分钟洗脱的戊二酸酯衍生物5h。该反应混合物用无水甲苯（3毫升） 稀释并在减压下浓缩。将粗产物溶解在无水DMF (2毫升）中并用二异丙基乙胺（22微升， 0. 126毫摩尔）和TSTU (38毫克，0. 126毫摩尔）处理。在搅拌15分钟后，如（c)部分中所 述的HPLC分析显示>80%转化成在Rt = 17. 2分钟洗脱的产物5i。通过如（d)部分中所述 的制备HPLC提纯产物。将含有产物的HPLC级分在-80°C下冻结并冷冻至干。将冻干产物 溶解在无水MeCN中并转移到配衡圆底烧瓶中并在减压下浓缩。产量=12. 3毫克（68%); MALDI-TOF MS 观察值 1423. 8。
[0098] 下列反应描述了 B04-AE-NHS，化合物5i的合成
实施例6 B1-AE-E2. 6b a)化合物6a。化合物If (26毫克，28. 7微摩尔）在无水DMF (2毫升）中的溶液用二 异丙基乙胺（7. 5微升，43微摩尔）和TSTU (10. 4毫克，35微摩尔）处理。在室温下搅拌该 反应。在 30 分钟后，使用 Phenomenex, C18 4.6 mm X 25 cm 柱和 10 - 100% B (A =含 0. 05% TFA的水，B =含0. 05% TFA的MeCN)在I. 0毫升/分钟流速下的30分钟梯度和在 260纳米的UV检测的反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 18. 2分钟洗脱的NHS 酯。将该反应逐滴添加到二氨基六（乙二醇）（美国专利No. 6, 664, 043) (40毫克，0· 142 毫摩尔)在无水DMF (2.0毫升)中的经搅拌溶液中。在30分钟后，反应混合物的HPLC分析 显示完全转化成在Rt = 14. 1分钟洗脱的产物6a。通过使用YMC，C18 30 X 300 mm柱和 在20毫升/分钟的溶剂流速下的如上所述的相同梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC 来提纯产物。合并含产物的HPLC级分并在减压下浓缩。产量=26毫克（78%);MALDI-TOF MS观察值1168. 6。
[0099] b) B1-AE-E2, 6b。将雌二醇-6-羧基甲基肟（1臺克，2. 78微摩尔）在DMF (0. 1 毫升)中与化合物6a (3. 25毫克，2. 78微摩尔)合并，并用二异丙基乙胺（1微升，5. 56微摩 尔)，接着用BOP试剂（1.84毫克，4. 17微摩尔)(作为在DMF中的溶液（0. 184毫升的10毫克 /毫升溶液）添加）处理。该反应在室温下搅拌2小时。如（a)部分中所述的HPLC分析显 示>80%转化成在Rt = 18. 2分钟洗脱的产物。通过使用YMC，C18 20 X 250 mm柱和在16 毫升/分钟的溶剂流速下的30分钟10 - 70% B (A =含0. 05% TFA的水，B =含0. 05% TFA的MeCN)梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC提纯产物。合并含产物的HPLC级 分，在-80°C下冻结并冷冻至干。产量=2. 8毫克（67%);MALDI-T0F MS观察值1511.2。
[0100] 下列反应描述了 B1-AE-E2，6b的合成。
[0101] 实施例7 B2-AE-E2. 7b a)化合物7a。化合物2e (30毫克，28微摩尔）在无水DMF (2毫升）中的溶液用二异 丙基乙胺（7.2微升，42微摩尔)和TSTU (10毫克，34微摩尔)处理。在室温下搅拌该反应。 在 30 分钟后，使用 Phenomenex, C18 4.6 mm X 25 cm 柱和 10 - 100% B (A =含 0.05% TFA的水，B =含0. 05% TFA的MeCN)在I. 0毫升/分钟流速下的30分钟梯度和在260纳 米的UV检测的反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 17. 7分钟洗脱的NHS酯。 将该反应逐滴添加到二氨基六（乙二醇）（美国专利No. 6, 664, 043) (40毫克，0· 142毫 摩尔)在无水DMF (1.0毫升)中的经搅拌溶液中。在30分钟后，反应混合物的HPLC分析显 示完全转化成在Rt = 14分钟洗脱的产物7a。通过使用YMC，C18 30 X 300 mm柱和在20 毫升/分钟的溶剂流速下的如上所述的相同梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC提纯 产物。合并含产物的HPLC级分并在减压下浓缩。产量=28. 3毫克（76%) ;MALDI-TOF MS 观察值1345. 4。
[0102] b) B2-AE-E2, 7b。将雌二醇-6-羧基甲基肟（1臺克，2. 78微摩尔）在DMF (0. 1 毫升)中与化合物7a (3. 74毫克，2. 78微摩尔)合并，并用二异丙基乙胺（1微升，5. 56微摩 尔)，接着用BOP试剂（1.84毫克，4. 17微摩尔)(作为在DMF中的溶液（0. 184毫升的10毫克 /毫升溶液）添加）处理。该反应在室温下搅拌2小时。如（a)部分中所述的HPLC分析显 示>80%转化成在Rt = 18. 1分钟洗脱的产物。通过使用YMC，C18 20 X 250 mm柱和在16 毫升/分钟的溶剂流速下的30分钟10 - 70% B (A =含0. 05% TFA的水，B =含0. 05% TFA的MeCN)梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC提纯产物。合并含产物的HPLC级 分，在-80°C下冻结并冷冻至干。产量=4. 6毫克（98 %);MALDI-T0F MS观察值1688. 4。
[0103] 下列反应描述了 B2-AE-E2，7b的合成。
[0104] 实施例8 B4-AE-E2. 8b a)化合物8a。化合物4e (26毫克，18微摩尔）在无水DMF (2毫升）中的溶液用二异 丙基乙胺（4. 0微升，27微摩尔)和TSTU(6. 6毫克，22微摩尔)处理。在室温下搅拌该反应。 在 30 分钟后，使用 Phenomenex, C18 4.6 mm X 25 cm 柱和 10 - 100% B (A =含 0.05% TFA的水，B =含0. 05% TFA的MeCN)在I. 0毫升/分钟流速下的30分钟梯度和在260纳 米的UV检测的反应混合物的HPLC分析显示完全转化成在Rt = 18. 7分钟洗脱的NHS酯。 将该反应逐滴添加到二氨基六（乙二醇）（美国专利No. 6, 664, 043) (25毫克，0· 089毫 摩尔)在无水DMF (2.0毫升)中的经搅拌溶液中。在30分钟后，反应混合物的HPLC分析显 示完全转化成在Rt = 15. 1分钟洗脱的产物8a。通过使用YMC，C18 30 X 300 mm柱和在 20毫升/分钟的溶剂流速下的如上所述的相同梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC提 纯产物。合并含产物的HPLC级分并在减压下浓缩。产量=22. 5毫克（73 %);MALDI-TOF MS观察值1698. 6。
[0105] b) B4-AE-E2, 8b。将雌二醇-6-羧基甲基肟（1臺克，2. 78微摩尔）在DMF (0. 1 毫升）中与化合物8a (4. 72毫克，2. 78微摩尔）合并，并用二异丙基乙胺（1微升，5. 56微 摩尔)，接着用BOP试剂（1.84毫克，4. 17微摩尔）（作为在DMF中的溶液（0. 184毫升的10 毫克/毫升溶液）添加）处理。该反应在室温下搅拌2小时。如（a)部分中所述的HPLC分 析显示>80%转化成在Rt = 18. 9分钟洗脱的产物。通过使用YMC，C18 20 X 250 mm柱 和在16毫升/分钟的溶剂流速下的30分钟的10 - 70% B (A =含0. 05% TFA的水，B = 含0. 05% TFA的MeCN)梯度和在260纳米的UV检测的制备HPLC提纯产物。合并含产物 的HPLC级分，在-80°C下冻结并冷冻至干。产量=4. 0毫克（70 %);MALDI-T0F MS观察值 2040.9。
[0106] 下列反应描述了 M-AE-E2，8b的合成。
[0107] 实施例9 用吖啶醅标iP,抗-TSH Mab的通用稈序。抗体的储备溶液（5毫克/毫升，50微升，0. 5 毫克，3. 4纳摩尔）用0· I M磷酸盐缓冲液pH 8 (150微升）或0· I M碳酸钠 pH 9 (150微 升)稀释成2. 5毫克/毫升溶液。向该溶液中加入20当量的作为DMF溶液的吖啶鑰NHS酯。 例如，使用B1-AE-NHS，这需要添加83微克作为8. 3微升的10毫克/毫升DMF溶液添加的 吖啶酯。
[0108] 将该标记反应在室温下温和搅拌3-4小时，然后用去离子水（1. 8毫升）稀释。然 后将这些稀释溶液转移到2毫升Centricon?过滤器（Mff 30, 000截留值）中并在4500G下 离心以将体积降至~〇. 2毫升。将这一过程再重复三次。将过滤的缀合物最后稀释到200 微升总体积的去离子水中以进行质谱分析和RLU测量。
[0109] 在Voyager DE MALDI-T0F质谱仪上记