一种基于移动柱塞的气动一体式PCR检测试剂盒及其检测方法与流程

一种基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒及其检测方法
技术领域
1.本发明涉及一种基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒及其检测方法，属于医学检测技术领域。


背景技术：

2.聚合酶链反应(polymerase chain reaction，pcr)是利用一段dna为模板，在dna聚合酶和核苷酸底物共同参与下，将该段dna扩增至足够数量，以便进行结构和功能分析。pcr检测方法在临床上快速诊断细菌性传染病等方面具有极为重要的意义。
3.在进行pcr检测时，通常需要对采集的样本进行裂解、清洗后再进行反应，早期一般采用分步进行操作的方式，期间需要不断转移样本至不同容器和药剂中，容易引入污染，严重影响到检测的精度。而微流控芯片可以把样本的制备、混合、反应、检测等步骤，以操作单元的方式移植到很小一块芯片上，并通过芯片上的微流管道网络进行材料的转移，将微流控芯片与pcr结合的芯片，虽然可以实现试剂消耗量小，分析速度快，自动化程度高等优点，但是其微流管道通常是平面式铺装，基于芯片小体积的要求，其内部管道较细，尺寸精度要求较高，对流量的控制精度也非常高。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于，提供一种基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒及其检测方法。它是一种空间利用率高、可控性强、操作简单、不易引入污染、检测精度更高的pcr检测试剂盒及检测方法。
5.本发明的技术方案：一种基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒，其特点是：包括盒体，盒体上设有第一柱塞腔，第一柱塞腔内设置有可在第一柱塞腔内移动的第一移动柱塞，所述第一移动柱塞中空并设有活塞，第一移动柱塞上设有进液口和出液口，出液口上设有过滤膜；盒体上设有多个储液仓，储液仓上设有连通至第一柱塞腔的液路，通过将第一移动柱塞移动至不同位置可以将进液口或出液口与储液仓连通，通过活塞的移动可以将储液仓和第一移动柱塞内的液体进行位置转移。利用第一移动柱塞作为转移暂存的载体和转移液体的动力机构，通过移动来进行步骤的切换。
6.上述的基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒中，所述储液仓上设有气孔，所述第一移动柱塞上设有连通至外部的气路，储液仓上设有与第一移动柱塞上的气路相连通的气路；当第一移动柱塞移动至与其中一个储液仓液路连通时，第一移动柱塞上的气路与储液仓的液路连通。各个储液仓上气路连通后，更易实现液体的转移。
7.前述的基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒中：所述储液仓中的一个或多个设置有加样口。根据需要可设为样本加入口、pcr反应物加入口及裂解/转化液加入口。样本加入口和裂解/转化液加入口也可共用一个，这里考虑的是直接将样本溶液和裂解/转化液混合加入到其中一个仓，进行样本的裂解或转化。
8.前述的基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒中，作为优选，所述加样口的数量为3个，分别为样本加入口、裂解/转化液加入口和pcr反应物加入口。这样设置可以使试剂盒应用范围更广，只需根据检测目标进行调整所加入的裂解/转化液和pcr反应物即可。
9.前述的基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒中，所述储液仓中包含用于样本预处理的预处理仓、用于pcr反应的pcr反应仓、用于储存结合液的结合液仓、用于储存清洗液的清洗液仓、用于储存洗脱液的洗脱液仓和用于储存废液的废液仓。洗脱液、一种或多种清洗液(包含脱磺化试剂等)、结合液等可预存储在这些储液仓内。
10.前述的基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒中，所述储液仓中包含用于储存稀释液的稀释液仓。
11.前述的基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒中，为了能够实现进一步的第二次pcr反应，需要将第一次pcr反应物分成多份，因此需要如下结构：所述盒体上设有第二柱塞腔，第二柱塞腔内设有第二移动柱塞；盒体上还设有多个用于分别连接外管的转移口；第二柱塞腔上分别设有与第一柱塞腔和转移口连通的液路；第二移动柱塞上设有连接液路，通过第二移动柱塞的位置移动可将第一柱塞腔与不同的转移口连通。
12.前述的基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒中，所述第二移动柱塞上设有与外部连通的通气孔，在第一柱塞腔与不同的转移口连通时，通气孔也与相应的转移口连通。
13.使用前述的基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒的检测方法中，包括以下步骤：
14.①
将样本核酸充分附着在第一移动柱塞的过滤膜上；
15.②
移动第一移动柱塞使进液口与储存清洗液的清洗液仓连通，抽动活塞，使清洗液进入第一移动柱塞；
16.③
移动第一移动柱塞使出液口与废液仓连通，下压活塞，使第一移动柱塞内的清洗液进入废液仓，清洗液流经过滤膜，从而对过滤膜上核酸进行清洗；
17.④
移动第一移动柱塞使进液口与洗脱液仓连通，抽动活塞，使洗脱液进入第一移动柱塞；
18.⑤
移动第一移动柱塞使出液口与pcr反应仓连通，下压活塞，使第一移动柱塞内的洗脱液进入pcr反应仓，洗脱液流经过滤膜，将过滤膜上核酸洗脱，一并进入pcr反应仓。
19.前述的检测方法中，所述步骤
①
的具体方法是：
20.1a、移动第一移动柱塞使进液口与用于储存裂解/转化液的储液仓连通，抽动活塞，使裂解/转化液进入第一移动柱塞；
21.1b、移动第一移动柱塞使出液口与用于储存样本溶液的储液仓连通，抽动活塞，使样本溶液进入第一移动柱塞；
22.1c、移动第一移动柱塞使出液口与预处理仓连通，下压活塞，使第一移动柱塞内的所有液体进入预处理仓进行裂解或转化；
23.1d、移动第一移动柱塞使进液口与结合液仓连通，抽动活塞，使结合液进入第一移动柱塞；
24.1e、移动第一移动柱塞使出液口与预处理仓连通，下压活塞，使结合液进入预处理仓；
25.1f、移动第一移动柱塞使进液口与预处理仓连通，抽动活塞，使将预处理仓内的所有液体吸入第一移动柱塞；
26.1g、重复步骤1e和1f多次；
27.1h、移动第一移动柱塞使出液口与废液仓连通，下压活塞，使第一移动柱塞内的所有液体进入废液仓，样本核酸充分附着在过滤膜上。
28.前述的检测方法中，为了进行多次清洗，所述步骤
②
和
③
重复多次，每次第一移动柱塞与多个不同的清洗液仓相连。
29.前述的检测方法中，是要实现pcr反应(第一次pcr反应)，需要在
⑤
后增加以下步骤：
30.⑥
移动第一移动柱塞使进液口与储存pcr反应物的储液仓连通，抽动活塞，使pcr反应物进入第一移动柱塞；
31.⑦
移动第一移动柱塞使出液口与pcr反应仓连通，下压活塞，使pcr反应物进入pcr反应仓与样本核酸进行pcr反应；
32.前述的检测方法中，如果需要对pcr反应产物进行二次扩增，即第二次pcr反应，需要在
⑤
后增加以下步骤：
⑧
移动第一移动柱塞使进液口与pcr反应仓连通，抽动活塞，使pcr反应产物进入第一移动柱塞；
33.⑨
移动第一移动柱塞使进液口与稀释液仓连通，抽动活塞，使稀释液进入第一移动柱塞，对pcr反应产物进行稀释；
34.⑩
同步移动第一移动柱塞和第二移动柱塞，使第一移动柱塞的出液口与其中一个转移口连通，定量下压活塞，使固定量的稀释后pcr反应产物通过转移口进入外管；
35.重复步骤
⑩
多次，每次只移动第二移动柱塞，使第一移动柱塞的出液口连通。
36.与现有技术相比，本发明以第一移动柱塞作为转移暂存的载体和转移液体的动力机构，并在试剂盒上集成多个储液仓，通过移动第一移动柱塞来使载体与不同的储液仓连通，并使用第一移动柱塞内的活塞来驱动转移液体，使得可以实现试剂在不同储液仓中转移，进而实现核酸提取所需的多个步骤。本发明充分发挥了第一移动柱塞的中转作用，试剂盒总体结构更加紧凑，空间利用率更高。其次，本技术还利用了设置在第一移动柱塞内的过滤膜作为吸附核酸的载体，可以克服传统磁珠法应用在本试剂盒上的弊端：如磁珠容易堵住液道，需要配合外部磁铁动作等。使用本发明的试剂盒，在检测是整个处理过程可与外界完全隔离，可避免引入外部污染因此检测精度更高。
37.本发明的检测方法是在基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒的使用而衍生的检测方法。它利用过滤膜作为截挡核酸的工具，通过操作移动柱塞的移动和活塞的移动，可方便地实现样本的预处理、清洗、洗脱、pcr反应等。
38.更进一步的，本发明的检测方法还可利用第二移动活塞，使pcr反应产物进行依次的均分，使用极为方便，便于实施第二次pcr反应。
附图说明
39.图1是本发明实施例1的结构示意图；
40.图2是图1的主体结构示意图；
41.图3是第一移动柱塞的结构示意图
42.图4是第二移动柱塞的的结构示意图。
具体实施方式
43.下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
44.实施例1：一种基于移动柱塞的气动一体式pcr检测试剂盒，如图1和图2所示，为方便理解，图2卸掉了两个移动柱塞：包括盒体1，盒体1上设有第一柱塞腔，第一柱塞腔内设置有可在第一柱塞腔内移动的第一移动柱塞2(结构如图3所示)，所述第一移动柱塞2中空并设有活塞201，第一移动柱塞2上设有进液口202和出液口203，出液口203上设有过滤膜204；盒体1上设有多个储液仓3，储液仓3上设有连通至第一柱塞腔的液路，通过将第一移动柱塞2移动至不同位置可以将进液口202或出液口203与储液仓3连通，通过活塞201的移动可以将储液仓3和第一移动柱塞2内的液体进行位置转移。所述储液仓3中的一个或多个设置有加样口。根据需要可设为样本加入口、pcr反应物加入口及裂解/转化液加入口。样本加入口和裂解/转化液加入口也可共用一个这里考虑的是直接将样本溶液和裂解/转化液混合加入到其中一个仓，进行样本的裂解或转化。图1和2作为优选方案，所述加样口的数量为3个，分别为样本加入口301、裂解/转化液加入口302和pcr反应物加入口303。
45.所述储液仓3上设有气孔，所述第一移动柱塞2上设有连通至外部的气路，储液仓102上设有与第一移动柱塞2上的气路相连通的气路；当第一移动柱塞2移动至与其中一个储液仓3液路连通时，第一移动柱塞2上的气路与储液仓3的液路连通。
46.所述储液仓3的功能设置如下：用于样本预处理的预处理仓304、用于pcr反应的pcr反应仓305、用于储存结合液的结合液仓306、用于储存清洗液的清洗液仓307、用于储存洗脱液的洗脱液仓308、用于储存废液的废液仓309和稀释液仓310。以及前述分别设置样本加入口301、裂解/转化液加入口302和pcr反应物加入口303的储液仓3。
47.所述盒体1上设有第二柱塞腔，第二柱塞腔内设有第二移动柱塞4(结构如图4所示)；盒体1上还设有多个用于分别连接外管5的转移口6；第二柱塞腔上分别设有与第一柱塞腔和转移口连通的液路；第二移动柱塞4上设有连接液路401，通过第二移动柱塞4的位置移动可将第一柱塞腔与不同的转移口6连通。所述第二移动柱塞4上设有与外部连通的通气孔402，在第一柱塞腔与不同的转移口6连通时，通气孔402也与相应的转移口6连通。
48.使用实施例所述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
49.①
将样本核酸充分附着在第一移动柱塞2的过滤膜204上；
50.②
移动第一移动柱塞2使进液口202与储存清洗液的清洗液仓307连通，抽动活塞201，使清洗液进入第一移动柱塞2；
51.③
移动第一移动柱塞2使出液口203与废液仓309连通，下压活塞201，使第一移动柱塞2内的清洗液进入废液仓309，清洗液流经过滤膜204，从而对过滤膜204上核酸进行清洗；
52.所述步骤
②
和
③
重复多次，每次第一移动柱塞2与多个不同的清洗液仓307相连。清洗液可为脱磺化试剂。
53.④
移动第一移动柱塞2使进液口202与洗脱液仓308连通，抽动活塞201，使洗脱液进入第一移动柱塞2；
54.⑤
移动第一移动柱塞2使出液口203与pcr反应仓305连通，下压活塞201，使第一移动柱塞2内的洗脱液进入pcr反应仓305，洗脱液流经过滤膜204，将过滤膜204上核酸洗脱，一并进入pcr反应仓305。
55.⑥
移动第一移动柱塞2使进液口202与储存pcr反应物的储液仓3连通，抽动活塞201，使pcr反应物进入第一移动柱塞2；
56.⑦
移动第一移动柱塞2使出液口203与pcr反应仓305连通，下压活塞201，使pcr反应物进入pcr反应仓305与样本核酸进行pcr反应；
57.其中所述步骤
①
的具体方法是：
58.1a、移动第一移动柱塞2使进液口202与用于储存裂解/转化液的储液仓3连通，抽动活塞201，使裂解/转化液进入第一移动柱塞2；
59.1b、移动第一移动柱塞2使出液口203与用于储存样本溶液的储液仓3连通，抽动活塞201，使样本溶液进入第一移动柱塞2；
60.1c、移动第一移动柱塞2使出液口203与预处理仓304连通，下压活塞201，使第一移动柱塞2内的所有液体进入预处理仓304进行裂解或转化；
61.1d、移动第一移动柱塞2使进液口202与结合液仓306连通，抽动活塞201，使结合液进入第一移动柱塞2；
62.1e、移动第一移动柱塞2使出液口203与预处理仓304连通，下压活塞201，使结合液进入预处理仓304；
63.1f、移动第一移动柱塞2使进液口202与预处理仓304连通，抽动活塞201，使将预处理仓304内的所有液体吸入第一移动柱塞2；
64.1g、重复步骤1e和1f多次；
65.1h、移动第一移动柱塞2使出液口203与废液仓309连通，下压活塞201，使第一移动柱塞2内的所有液体进入废液仓309，样本核酸充分附着在过滤膜204上。
66.为了进一步进行二次分配，所述步骤
⑦
后还包括以下步骤：
67.⑧
移动第一移动柱塞2使进液口202与pcr反应仓305连通，抽动活塞201，使pcr反应产物进入第一移动柱塞2；
68.⑨
移动第一移动柱塞2使进液口202与稀释液仓309连通，抽动活塞201，使稀释液进入第一移动柱塞2，对pcr反应产物进行稀释；
69.⑩
同步移动第一移动柱塞2和第二移动柱塞4，使第一移动柱塞2的出液口203与其中一个转移口6连通，定量下压活塞201，使固定量的稀释后pcr反应产物通过转移口6进入外管5；
70.重复步骤
⑩
多次，每次只移动第二移动柱塞4，使第一移动柱塞2的出液口203依次与各个转移口6连通。实施例2。在实施例1的基础上，省去第二移动柱塞4及转移口6，也无需稀释液仓310。该试剂盒仅作一次pcr反应，不做二次分配。因此检测方法只需省略步骤
71.其中，外管5可以是实验室中常用的8连管，掀掉盖子直接添加pcr第二次反应物；外管5与转移口6扣合在一起后，有一定的密封性；外管无色透明，可从侧边进行荧光检测。