专利名称：从马蹄粉产粉废水中提取抑菌物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抑菌作用的植物及其有效抑菌物质的提取工艺。特别涉及从马蹄粉产粉废水中提取具有抑菌性物质的方法。
背景技术：
荸荠(Helocharis tuberosa Schulut)又称地栗、马蹄、乌芋等，属莎草科多年生浅水草本植物。在我国的栽培和食用已有三千年的历史(刘剑秋，1999)，其可食部分为地下球茎，内含丰富的淀粉、糖、多种维生素及矿物质，并具有一定的药用价值，是一种优良的药食兼用的果蔬类食品，北方人视之为“江南人参”。祖国传统医学认为，荸荠乃药中佳品。其果实及地上茎(俗称通天草)为传统的中药材，性寒味甘，有清热、化痰、消积等功效，能治疗黄疸、热淋，痞积、目赤、咽喉肿痛等症；据《本草纲目》记载荸荠能消渴痹热，温水益气；《食疗本草》上记载荸荠能下丹石，消风毒，除胸中实热；《医林篡要》中记载荸荠能补心益肺、滋阴化痰、去结核、解酒醒酒、止咳除烦。有研究表明，将荸荠与山楂并用，在一定程度上还可以起到开胃消食，强心降压，疏缓血管的作用。上海肿瘤防治研究协作组在筛选中药时发现，荸荠的各种制剂在动物体内均有抗癌作用，新加坡中医学报曾介绍食用荸荠可治疗食道癌。有关实验证明荸荠对体内重金属铅、镉等具有良好的促排作用。《中药大辞典》中认为荸荠英是荸荠中主要的活性成份，民间将荸荠英又称作马蹄黄，据说在荸荠果皮与果肉之间的部位富集比较多。目前国内外尚没有对荸荠英的抑菌消炎作用及其有效物质进行研究。
技术内容本发明的任务是提出一种能带给马蹄粉生产企业经济附加值的工艺，即从马蹄粉厂产粉废水中提取具有抑菌性物质的方法。该抑菌物质对食品中常见污染菌及致病菌有抑制及杀灭作用。
此外经试验证明，此抑菌物质相当稳定，在酸碱性试验中，随着pH的升高，抑菌物质对菌体的抑制能力只有少量下降。对温度也不敏感，仅在121℃处理30min后，抑菌能力才开始减弱。在紫外和离子的影响实验中，发现二者对此物质的抑菌性能几无影响。
本发明的任务是通过以下两部分工艺实现的1.抑菌粗品的制备a.马蹄粉产粉废水的产生过程马蹄→清洗→打浆→渣浆分离→大量清水冲洗废渣并与浆液合并→液体静置使得淀粉充分沉淀→取淀粉，其余液态物质排出(废水)b.将废水自然沉降1～2天，取其底部的浆状物。
c.将浆状物用离心机(5000转/秒)离心处理10～15分钟至浆状物分层明显，去上清液层及下层淀粉层。将中间层部分于50～55℃中干燥成块，即为抑菌活性成分粗品。
2.抑菌物质的纯化提取a.将抑菌粗品用40％～85％的乙醇或纯甲醇于50～70℃水浴浸泡2～3小时，以充分浸提有效物质。或者用95％的乙醇或纯甲醇直接浸泡1周，反覆浸提2～3次，充分提取有效物质。
b.用定性滤纸过滤，以相应的浸提有机试剂洗涤滤渣2～3次，合并滤液。将滤液于低于50℃，0.1大气压下蒸馏至膏状，得乙醇提取物。
c.加入2倍体积的水于此提取物中，搅拌制成悬浮液。然后依次用极性从小到大的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三种有机溶剂通过两相萃取分部。每次有机溶剂的用量均为所制成悬浮液体积的五倍，分多次萃取至悬浮液无色。得到四个部分，石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分。各部分再次通过低于50℃，0.1大气压蒸镏除去有机试剂得到各部分提取物。
d.石油醚部分的提取物无抑菌性，弃去。
e.对乙酸乙酯部分的提取物进行200～300目硅胶柱层析，以提取物与吸附剂体积比1∶8的比例来装柱。用石油醚∶乙酸乙酯混合体系来洗脱。浓度梯度体积比为9.5∶0.5，9∶1，8∶2，7∶3，5∶5，3∶7，2∶8，9∶1，每个浓度梯度均配300ml洗脱液。每100ml收一个流份，共24个流份。将17～19的流分合并，于低于50℃，0.1大气压蒸馏得到抑菌活性组分A。
f.对正丁醇部分的提取物进行200～300目硅胶柱层析，以提取物与吸附剂体积比1∶8的比例来装柱。用氯仿∶甲醇混合体系来洗脱。浓度梯度体积比为9∶1，8.5∶1.5，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，0∶10每个浓度梯度均配300ml洗脱液。每100ml收一个流份，共21个流份。将5～11的流分合并减压蒸馏，于低于50℃，0.1大气压蒸馏得到抑菌活性组分B。
g.对水部分的提取物进行200～300目硅胶柱层析，以提取物与吸附剂体积比1∶8的比例来装柱。用氯仿∶甲醇混合体系来洗脱。浓度梯度体积比为9∶1，8.5∶1.5，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，0∶10每个浓度梯度均配300ml洗脱液。每100ml收一个流份，共21个流份。将6～8的流分合并减压蒸馏，于低于50℃，0.1大气压蒸馏得到抑菌活性组分C。
h.将活性成分A、B、C混合，得到纯度较高的抑菌活性物质。
此抑菌物质经活性试验表明，对食品中常见污染菌及致病菌具有明显的抑制及杀灭作用，在中性条件下，其效果明显强于传统的化学合成防腐剂如山梨酸钾、苯甲酸钠等。此抑菌物质添加量为3.13％就有抑菌现象，当添加量为50％时抑菌性能是同等条件下浓度为60％山梨酸钾抑菌性能的105％(金黄葡萄球菌)、140％(大肠杆菌)、141％(枯草芽孢杆菌)。
下列表1、表2、表3为试验情况表。表1为抑菌物质对常见污染菌的抑菌状况实验情况表。
山梨酸钾实验菌种 50％ 25％ 12.5％6.25％3.13％ CK(60％)金色葡萄球菌 15.2±0.3 9.0±0.1 7.7±0.6 7.3±0.4 5.9±0.2 14.5±0.6 5.5枯草芽孢杆菌 8.8±0.4 8.6±0.2 7.2±0.2 6.8±0.2 6.3±0.1 6.2±0.2 5.5大肠杆菌 12.1±0.2 9.3±0.1 8.7±0.2 7.7±0.2 7.2±0.2 8.7±0.4 5.5表1体外实验表明，中性条件下，此抑菌物质对金色葡萄球菌的抑菌浓度可低达0.063％，对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌的最低抑菌浓度则为0.125％。而山梨酸钾只有浓度达到2％时，对细菌才显示抑菌活性。并且通过与山梨酸钾在其它条件下的抑菌作用比较发现，即便在酸性条件下，此抑菌物质的抑菌效果仍略高于山梨酸钾。
表2为抑菌物质对食品常见污染菌的MIC表，表中“-”表示没有菌生长，“+”表示有长菌。
表3为山梨酸钾对食品常见污染菌的最低抑菌浓度确定试验表，表中“-”表示没有菌生长，“+”表示有长菌。
浓度(％) 421 0.5 0.25 0.125 0.063 0.031 0.016 CK枯草芽孢杆菌 --- --- --- --- --- --- +++ +++ +++ +++大肠杆菌 --- --- --- --- --- --- ++- +++ +++ +++沙门氏菌 --- --- --- --- --- --- +++ +++ +++ +++金色葡萄球菌 --- --- --- --- --- --- --- +++ +++ +++啤酒酵母 --- --- +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++假丝酵母 --- --- --- --- --- +++ +++ +++ +++ +++米曲霉--- +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++黑曲霉+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++表2浓度(％) 421 0.5 0.25 CK枯草芽孢杆菌 +++ +++ +++ +++ +++ +++大肠杆菌 +++ +++ +++ +++ +++ +++沙门氏菌 --- +++ +++ +++ +++ +++金色葡萄球菌 --- +++ +++ +++ +++ +++啤酒酵母 --- --- --- --- --- +++假丝酵母 --- --- --- --- +++ +++米曲霉--- --- --- --- --- +++黑曲霉--- --- --- --- --- +++表3试验证明，此抑菌物质相当稳定。在酸碱性试验中，随着pH的升高，抑菌物质对菌体的抑制能力只有少量下降。对温度也不敏感，仅在121℃处理30min后，抑菌能力才开始减弱。在紫外照射影响实验中，发现紫外光对此物质的抑菌性能几无影响。
图1为pH值对提取物抑菌活性的影响。图中-▲-线表示大肠杆菌在不同pH条件下被提取物的抑制程度，通过抑菌圈直径反映。图中-■-线表示金色葡萄球菌在不同pH条件下被提取物的抑制程度，通过抑菌圈直径反映。图中横坐标为pH值。纵坐标为抑菌圈直径的大小，单位mm。此图反映随着pH的升高，抑菌物质对菌体的抑制能力只有少量下降。
图2为温度对提取物抑菌活性的影响。图中-▲-线表示大肠杆菌在不同温度条件下被提取物的抑制程度，通过抑菌圈直径反映。图中-■-线表示金色葡萄球菌在不同温度条件下被提取物的抑制程度，通过抑菌圈直径反映。图中横坐标为不同的温度值，单位℃。纵坐标为抑菌圈直径的大小，单位mm。由此图可以看出此提取物对温度也不敏感，仅在121℃处理30min后，抑菌能力才开始减弱。
图3为紫外照射对提取物抑菌活性的影响。图中-▲-线表示在不同紫外光照射时间下大肠杆菌被提取物的抑制程度，通过抑菌圈直径反映。图中-■-线表示在不同紫外光照射时间下金色葡萄球菌被提取物的抑制程度，通过抑菌圈直径反映。图中横坐标为不同的紫外光照射时间，单位min。纵坐标为抑菌圈直径的大小，单位mm。此图表明，紫外光对此物质的抑菌性能几无影响。
提取工艺示例1.抑菌粗品的制备a.马蹄粉产粉废水的产生过程马蹄→清洗→打浆→渣浆分离→大量清水冲洗废渣并与浆液合并→液体静置使得淀粉充分沉淀→取淀粉，其余液态物质排出(废水)b.将废水自然沉降1天，取其底部的浆状物。
c.将浆状物用离心机(5000转/秒)离心处理l0～15分钟至浆状物分层明显，去上清液层及下层淀粉层。将中间层部分于50～55℃烘箱中干燥成块，即为抑菌活性成分粗品。
2.抑菌物质的纯化提取a.将抑菌粗品用40％的乙醇于60℃水浴浸泡2小时，以充分浸提有效物质。
b.用定性滤纸过滤，以相应的浸提有机试剂洗涤滤渣2～3次，合并滤液。将滤液于低于50℃的温度，0.1大气压下减压蒸馏至膏状，得乙醇提取物。
c.于加入2倍体积的水此提取物，搅拌制成悬浮液。然后依次用极性从小到大的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三种有机溶剂通过两相萃取分部。每次有机溶剂的用量均为所制成悬浮液体积的五倍，分5次萃取至悬浮液无色。得到四个部分，石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分。各部分再次通过低于50℃，0.1大气压蒸镏除去有机试剂得到各部分提取物。
d.石油醚部分的提取物无抑菌性，弃去。
e.对乙酸乙酯部分的提取物进行200～300目硅胶柱层析，以提取物与吸附剂体积比1∶8的比例来装柱。用石油醚∶乙酸乙酯混合体系来洗脱。浓度梯度体积比为9.5∶0.5，9∶1，8∶2，7∶3，5∶5，3∶7，2∶8，9∶1，每个浓度梯度均配300ml洗脱液。每100ml收一个流份，共24个流份。将17～19的流分合并，于低于50℃，0.1大气压蒸馏得到抑菌活性组分A。
f.对正丁醇部分的提取物进行200～300目硅胶柱层析，以提取物与吸附剂体积比1∶8的比例来装柱。用氯仿∶甲醇混合体系来洗脱。浓度梯度体积比为9∶1，8.5∶1.5，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，0∶10每个浓度梯度均配300ml洗脱液。每100ml收一个流份，共21个流份。将5～11的流分合并减压蒸馏，于低于50℃，0.1大气压蒸馏得到抑菌活性组分B。
g.对水部分的提取物进行200～300目硅胶柱层析，以提取物与吸附剂体积比1∶8的比例来装柱。用氯仿∶甲醇混合体系来洗脱。浓度梯度体积比为9∶1，8.5∶1.5，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，0∶10每个浓度梯度均配300ml洗脱液。每100ml收一个流份，共21个流份。将6～8的流分合并减压蒸馏，于低于50℃，0.1大气压蒸馏得到抑菌活性组分C。
h.将活性成分A、B、C混合，得到纯度较高的抑菌活性物质。
权利要求
1.从马蹄粉产粉废水中提取抑菌物质的方法，其特征在于将马蹄产粉后的废水自然沉降1～2天，取其底部的浆状物，离心处理至浆状物分层明显，去上清液层及下层淀粉层，将中间层部分于50～55℃干燥成块，即为抑菌活性成分粗品；将抑菌粗品用40％～85％的乙醇或纯甲醇于50～70℃水浴浸泡2～3小时，以充分浸提有效物质，或者用95％的乙醇或纯甲醇直接浸泡1周，反覆浸提2～3次，充分提取有效物质；用定性滤纸过滤上述浸提液，以相应的浸提有机试剂洗涤滤渣2～3次，合并滤液；将滤液于低于50℃，0.1大气压下蒸馏至膏状，得乙醇提取物；加入2倍体积的水于此提取物中，搅拌制成悬浮液，然后依次用极性从小到大的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三种有机溶剂通过两相萃取分部，每次有机溶剂的用量均为所制成悬浮液体积的五倍，经多次萃取至悬浮液无色，得到四个部分，石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分，各部分再次通过低于50℃，0.1大气压蒸镏去有机试剂得到各部分提取物；石油醚部分的提取物无抑菌性，弃去；对乙酸乙酯部分的提取物进行200～300目硅胶柱层析，以提取物与吸附剂体积比1∶8的比例来装柱，用石油醚∶乙酸乙酯混合体系来洗脱，浓度梯度体积比为9.5∶0.5，9∶1，8∶2，7∶3，5∶5，3∶7，2∶8，9∶1，每个浓度梯度均配300ml洗脱液，每100ml收一个流份，共24个流份，将17～19的流分合并，于低于50℃，0.1大气压蒸镏得到抑菌活性组分A；对正丁醇部分的提取物进行200～300目硅胶柱层析，以提取物与吸附剂体积比1∶8的比例来装柱，用氯仿∶甲醇混合体系来洗脱，浓度梯度体积比为9∶1，8.5∶1.5，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，0∶10每个浓度梯度均配300ml洗脱液，每100ml收一个流份，共21个流份，将5～11的流分合并，于低于50℃，0.1大气压蒸镏得到抑菌活性组分B；对水部分的提取物进行200～300目硅胶柱层析，以提取物与吸附剂体积比1∶8的比例来装柱，用氯仿∶甲醇混合体系来洗脱，浓度梯度体积比为9∶1，8.5∶1.5，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，0∶10每个浓度梯度均配300ml洗脱液，每100ml收一个流份，共21个流份，将6～8的流分合并，于低于50℃，0.1大气压蒸镏得到抑菌活性组分C；将活性成分A、B、C混合，得到纯度较高的抑菌活性物质。
全文摘要
本发明涉及一种抑菌物质的提取工艺。特别涉及从马蹄粉产粉废水中提取抑菌物质的方法。即将产粉废水沉降后取得的浆状物经过离心、干燥制得抑菌物粗品；再将此粗品用乙醇、甲醇浸提，低温减压蒸馏得乙醇浸提物；以水悬浮此物，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三种有机溶剂分别通过两相萃取分部，各部再次通过低温减压蒸馏制得提取物；最后各部提取物经过柱层析纯化后，分别得到抑菌活性组分A、B、C，合并后得到纯度较高的抑菌活性物质。该抑菌物质对食品中常见污染菌及致病菌具有明显的抑制及杀灭作用，且其自身有较高的稳定性。
文档编号C02F9/02GK1528684SQ20031011181
公开日2004年9月15日 申请日期2003年10月17日 优先权日2003年10月17日
发明者刘欣, 郝淑贤, 赵力超, 周爱梅, 刘 欣 申请人:华南农业大学