专利名称：在非灭菌环境抑制杂菌生长的白腐真菌固定化方法
技术领域：
本发明属于应用微生物领域，特别涉及在非灭菌环境培养和使用白腐真菌降解活性染料时的一种在非灭菌环境抑制杂菌生长的白腐真菌固定化方法。
背景技术：
随着染料工业的迅速发展，目前使用的染料已达数万种。含染料废水来自纺织、印染、染料制造等多个工业行业，是国内外公认的难处理的工业废水。
目前，在含染料废水处理研究中，出现了许多新工艺、新技术，如膜技术和高级氧化技术。这些新技术、新方法可以对复杂的含染料废水进行脱色，也能达到较高的处理效果。但是，这些工艺存在一个共同的缺点，就是工程投资和运行成本相当高，实际工程难以承受。因此，尽管生物处理也存在诸多问题，但是由于它的低成本使它仍然是解决含染料废水污染问题的最好方法。
近年来，许多研究表明在含染料废水处理中白腐真菌(White rot fungi)是很有发展前景的微生物，其中研究和讨论得最多的是黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chryosporium)。黄孢原毛平革菌因其具有非特异性、无需底物诱导的酶，对许多有机污染物和不同类型的人工合成染料(如偶氮，三苯甲烷，酞菁染料)具有广谱的降解能力，并且它能通过所分泌的特殊的降解酶系及其它机制将各种人工合成的染料彻底降解为CO2和H2O。从80年代后期，国外就有科研人员研究应用白腐真菌降解各种合成染料，证明其在严格灭菌条件下可以降解多种染料。国内在90年代中后期才有少数科研人员开始研究白腐真菌对活性染料的降解，最近几年这种研究呈上升趋势，但同国外相比还存在很大差距。然而，无论国内还是国外，对白腐真菌处理染料废水研究都还停留在实验室研究阶段，应用到实际工程中的案例基本没有。那么是什么制约其在实际工程中应用呢？白腐真菌有别于细菌，它属于真核微生物，生长速度很慢。因此，一旦反应体系有细菌进入，细菌就会与白腐真菌争夺培养基中的营养物质，由于细菌的繁殖速度比真菌快很多，这样，细菌就会在反应体系内占优势，而白腐真菌因缺乏营养将停止生长，进而影响胞外降解酶系的分泌，使整个处理系统失去降解染料的功能。由此可知，只有解决白腐真菌降解系统的染菌问题，才能使白腐真菌降解染料技术应用到实际工程中。采用在实验室研究中采用的灭菌手段来解决染菌问题，显然在实际工程中是行不通的，因为它将大大提高工艺的运行成本，即使在国外，采用灭菌手段来解决污水处理过程中的染菌问题也是没有先例的。最近几年，国外已经认识到染菌问题是制约白腐真菌处理技术工业化的瓶颈问题，并开始着手研究解决这一问题，取得了一些研究成果。
但是，通过检索中外文献，只发现两篇研究应用白腐真菌降解染料时的抑菌技术，一个为采用聚乙烯醇包埋法来保护白腐真菌Trametes versicolor和细胞外产生的过氧化物酶免受细菌攻击，从而达到对染料Poly R-478的连续生物氧化。但包埋法的问题是，由于白腐真菌不断生长逐渐会挣破聚乙烯小球，使菌丝体暴露出来，影响抑菌效果(Leidig E，et al.Biotransformation of Poly R-478by continuous cultures of PVAL-encapsulated Trametes versicolor undernon-sterile conditions.Bioprocess Eng，1999，215-12.)。另一篇为通过控制低pH值，氮限制培养基和天然载体研究应用白腐真菌Trametes versicolor在非灭菌环境降解活性染料的控制策略，但文中提到单单依靠控制低pH和限氮培养基很难获得长期的抑菌效果(Judy A，et al.Competition strategies forthe decolorization of a textile-reactive dye with the white-rot fungiTrametes versicolor under non-sterile conditions.Biotechnilogy andBioengineering，2003，82(6)736-744.)。另外，以上两种抑菌技术均是采用Trametes versicolor菌种，而采用黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)进行非灭菌环境抑制杂菌方法研究，除本课题组外，还未见其他研究人员报道。
综上，有关非灭菌环境如何培养白腐真菌和使用它降解活性染料的研究还比较初步，目前还没有能够在非灭菌环境培养白腐真菌并能有效抑制杂菌生长的方法。
发明内容
本发明的目的是提供在自然环境(非灭菌环境)下黄孢原毛平革菌培养以及后续对活性染料降解过程中的一种在非灭菌环境抑制杂菌生长的白腐真菌固定化方法。其特征在于，该方法包括1)菌种选择白腐真菌采用黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，2)液体培养基选用前期发明的非灭菌环境白腐真菌降解活性染料的抑制细菌生长培养基，该抑菌培养基能在经灭菌培养白腐真菌5天后在非灭菌环境脱色活性染料阶段很好的抑制细菌。
3)载体白腐真菌固定化载体以采用250mL锥形瓶，100mL液体培养基进行正交试验选择，从不锈钢网、尼龙网、玻璃纤维网和聚氨酯泡沫中筛选出具有最佳抑杂菌效果的惰性载体—聚氨酯泡沫载体，载体大小为1.0×1.0×1.0cm3，载体的质量为1.2g，载体的形状为三棱柱结构。
4)培养过程将聚氨酯泡沫载体放入锅中煮沸30min，烘干后用百分之一天平称取1.2g三棱柱体聚氨酯泡沫载体，将其投放到含有100mL液体培养基(清华大学环境科学与工程系环境模拟与污染控制国家重点联合实验室研制)的250mL锥形瓶中，此时载体堆积高度高出液面，处于非浸没状态，将载体和液体培养基一起放入灭菌锅中在100～120℃下灭菌20～40min，灭菌结束后，用注射器和针头式过滤器(带膜灭菌)向100ml液体培养基过滤加入100mg/L维生素B1溶液1ml，并保持液体培养基中维生素B1的终浓度为1mg/L；然后，将生长在35～40℃PDA平板上的黄孢原毛平革菌BKM-F-1767孢子等量无菌接入液体培养基中，接种量为1×105个孢子/ml，再将锥形瓶放入温度为35～38℃的恒温摇床中，转速设为160rpm，在自然(非灭菌)空气条件下培养在非灭菌环境进行白腐真菌的培养，培养期间5天。
5)对活性染料的降解，非灭菌培养5天后，在非灭菌环境下向含有白腐真菌和液体培养基的锥形瓶中加入未经灭菌处理的活性艳红K-2BP溶液(1000mg/L)3ml，保持锥形瓶内溶液中活性艳红K-2BP的浓度为30mg/L，时间24小时。
所述PDA平板为200g/L土豆汁、20g/L葡萄糖和20g/L琼脂的均匀混合液。
本发明的有益效果是本发明的方法不仅在5天培养期间内没有感染其它杂菌，而且在活性染料降解阶段获得了稳定、达到对活性艳红K-2BP的脱色率95％以上的高效脱色效果，其脱色率与灭菌环境得到的结果基本一致。因此，本发明使用方便，抑菌材料价格低廉、易得，抑杂菌效果好，木质素降解酶产量高，为实际工程应用白腐真菌处理含染料废水提供了可能，并在实际中降低了因灭菌条件带来的运行成本。
具体实施例方式
本发明提供在自然环境(非灭菌环境)下黄孢原毛平革菌培养以及后续对活性染料降解过程中的一种在非灭菌环境抑制杂菌生长的白腐真菌固定化方法。该方法采用黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)作为白腐真菌，白腐真菌固定化载体以采用250mL锥形瓶，100mL液体培养基进行正交试验选择，从不锈钢网、尼龙网、玻璃纤维网和聚氨酯泡沫中筛选出具有最佳抑杂菌效果的惰性载体—聚氨酯泡沫载体，将聚氨酯泡沫剪成1.0×1.0×1.0cm3立方体，然后从对角线处将其一分为二，使其成为两个三棱柱体，以此制备三棱柱体载体。将聚氨酯泡沫载体放入锅中煮沸30min，烘干后用百分之一天平称取1.2g三棱柱体聚氨酯泡沫载体，将其投放到含有100mL液体培养基的锥形瓶中(250mL)。此时载体堆积高度高出液面，处于非浸没状态。所采用的液体培养基为前期发明的抑制细菌生长培养基(见清华大学环境科学与工程系环境模拟与污染控制国家重点联合实验室的发明专利200410073821.4)。将载体和液体培养基一起放入灭菌锅中在113℃下灭菌30min。灭菌结束后，用注射器和针头式过滤器(带膜灭菌)向100ml液体培养基过滤加入1ml 100mg/L维生素B1溶液，保持液体培养基中维生素B1的终浓度为1mg/L。然后，将生长在37℃ PDA平板(200g/L土豆汁、20g/L葡萄糖和20g/L琼脂)上的黄孢原毛平革菌BKM-F-1767孢子等量无菌接入液体培养基中，接种量为1×105个孢子/ml。再将锥形瓶放入温度为37℃的恒温摇床中，转速设为160rpm，在自然(非灭菌)空气条件下培养。非灭菌培养5天后，在非灭菌环境下向含有白腐真菌和液体培养基的锥形瓶中加入未经灭菌处理的活性艳红K-2BP溶液(1000mg/L)3ml，保持锥形瓶内溶液中活性艳红K-2BP的浓度为30mg/L。24h后，非灭菌环境投加活性艳红K-2BP的3个锥形瓶内活性艳红K-2BP的脱色率均在95％以上；与灭菌环境投加活性艳红K-2BP相比，二者脱色率基本相同。并对培养和脱色期间的培养液进行镜检，只在脱色第5天发现有极少量酵母菌，并未对脱色系统造成影响。
权利要求
1.一种在非灭菌环境抑制杂菌生长的白腐真菌固定化方法，其特征在于，该方法包括1)菌种选择白腐真菌采用黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)，2)液体培养基选用现有的非灭菌环境白腐真菌降解活性染料的抑制细菌生长培养基，该抑菌培养基能在经灭菌培养白腐真菌5天后在非灭菌环境脱色活性染料阶段很好的抑制细菌；3)载体白腐真菌固定化载体以采用250mL锥形瓶，100mL液体培养基进行正交试验选择，从不锈钢网、尼龙网、玻璃纤维网和聚氨酯泡沫中筛选出具有最佳抑杂菌效果的惰性载体一聚氨酯泡沫载体，载体大小为1.0×1.0×1.0cm3，载体的质量为1.2g，载体的形状为三棱柱结构；4)培养过程将聚氨酯泡沫载体放入锅中煮沸30min，烘干后用百分之一天平称取1.2g三棱柱体聚氨酯泡沫载体，将其投放到含有100mL液体培养基(清华大学环境科学与工程系环境模拟与污染控制国家重点联合实验室研制)的250mL锥形瓶中，此时载体堆积高度高出液面，处于非浸没状态，将载体和液体培养基一起放入灭菌锅中在110～120℃下灭菌20～40min，灭菌结束后，用注射器和针头式带膜灭菌过滤器向100ml液体培养基过滤加入100mg/L维生素B1溶液1ml，并保持液体培养基中维生素B1的终浓度为1mg/L；然后，将生长在35～38℃PDA平板上的黄孢原毛平革菌BKM-F-1767孢子等量无菌接入液体培养基中，接种量为1×105个孢子/ml，再将锥形瓶放入温度为35～38℃的恒温摇床中，转速设为160rpm，在自然空气条件下培养在非灭菌环境进行白腐真菌的培养，培养期间5天；5)对活性染料的降解，非灭菌培养5天后，在非灭菌环境下向含有白腐真菌和液体培养基的锥形瓶中加入浓度为1000mg/L的未经灭菌处理的活性艳红K-2BP溶液3ml，保持锥形瓶内溶液中活性艳红K-2BP的浓度为30mg/L，时间为24小时。
全文摘要
本发明公开了属于微生物应用领域的一种在非灭菌环境抑制杂菌生长的白腐真菌固定化方法。该方法是在抑制细菌生长液体培养基的基础上，采用黄孢原毛平革菌作为白腐真菌，通过正交试验筛选出具有最佳抑杂菌效果的惰性载体－聚氨酯泡沫载体，将聚氨酯泡沫作成两个三棱柱体，通过向液体培养基投加聚氨酯泡沫载体对白腐真菌进行固定化，利用聚氨酯泡沫本身的结构特点，并结合抑制细菌生长培养基，经过对比试验，不仅在培养期间内没有感染其它杂菌，而且在活性染料降解阶段获得了稳定脱色率，脱色率达到95％以上，与灭菌环境得到的结果基本一致。本发明使用方便，抑菌材料价格低廉、易得，抑杂菌效果好，并在实际中降低了因灭菌条件带来的运行成本。
文档编号C02F3/34GK1793354SQ20051012567
公开日2006年6月28日 申请日期2005年12月5日 优先权日2005年12月5日
发明者高大文, 文湘华, 钱易 申请人:清华大学