一种利用深山含笑叶粗酶液清除双酚A的方法与流程

本发明属于有机化工技术领域，尤其涉及一种利用深山含笑叶粗酶液清除双酚A的方法。

背景技术：

双酚A(bisphenol A，BPA)是一种重要的有机化工原料，广泛应用于聚碳酸酯、环氧树脂、阻燃剂、增塑剂、橡胶抗老化剂等生产中，用这些材料生产的终端产品，如婴儿奶瓶，微波炉饭盒、食品包装盒、饮料罐等均含有BPA。BPA的广泛应用带来了日渐严重的环境污染：在日本垃圾处理场和堆肥水样中均可检出BPA，其平均浓度达269μg/L。BPA等酚类化合物是内分泌干扰物(Endocrine Disrupting Chemicals，即EDCs)的重要成员之一，20世纪80年代以来的系列研究表明，BPA对水生生物和人体细胞具有雌激素作用和生物学毒性；能干扰人体内正常激素的分泌，导致儿童性发育提前，进而影响生殖功能，同时增加肿瘤的发病率；即使是低剂量染毒，也能造成严重的损伤。EDCs具有生物富集、效用持久以及生理学响应浓度极低等特性，使得其在水体中很难通过传统水处理技术去除。近几年来，BPA在水体中检出浓度有逐年增大的趋勢。因此，如何处理水环境中BPA成为急需解决的难题。深山含笑(学名：Michelia maudiae Dunn)，又名光叶白兰、莫夫人玉兰，木兰科含笑属，常绿乔木。中国特有物种，主要分布在浙江、福建、湖南、广东、广西、贵州等地。具有生长快、材质好，叶片冬季不凋，早春花色纯白艳丽、味清香等特性。其树型美观，主要作为园林观赏树种；其大量叶片未得到充分利用。发明人通过测定证实，深山含笑叶片中含有较高过氧化物酶活性，该酶具有较好的温度、酸碱稳定性。目前对环境中双酚A的消除主要采用物理吸附、光催化的化学降解、生物降解等方法；利用吸附和膜工艺等常规水处理方法的去除效果显著，但缺点是费用较高，需要特定的厂房及相关仪器，只能作为医疗、饮用等特殊用途的水处理方法。此外，采用Zn0.9Fe0.1S硫化物为光催化剂，在紫外光、催化剂、H2O2体系下催化氧化BPA，其去除率可达90％以上；但光催化剂制备过程复杂，且催化剂发挥催化氧化效应的条件苛刻，降低了应用场景。近年来，生物法中的微生物法以其密度高、处理设备简单等特点得到广泛应用，这种方法虽然安全，但实际的污水环境相当恶劣，微生物对生存条件有很大的要求，一旦处于恶劣的环境中，生存能力必然受到限制，而且利用微生物降解酚类废水则需要大规模培养微生物且耗时长、空间大，同时含酚废水对微生物存在毒害作用。难以大规模用于含酚废水的处理。

综上所述，现有技术存在的问题是：目前对环境中双酚A的消除方法存在光催化剂制备过程复杂，且催化剂发挥催化氧化效应的条件苛刻，降低了应用场景；需要大规模培养微生物且耗时长、空间大，同时含酚废水对微生物存在毒害作用；而采用植物源过氧化物酶清除BPA则可以有效克服上述问题。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用深山含笑叶粗酶液清除双酚A的方法。

本发明是这样实现的，一种利用深山含笑叶粗酶液清除双酚A的方法，所述利用深山含笑叶粗酶液清除双酚A的方法包括：

步骤一，称取成熟深山含笑树叶，按1:50比例加入不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮，在液氮中迅速研磨，再按照1:5比例加入含10％聚乙烯吡咯烷酮和2mmol/L乙二胺四乙酸的磷酸缓冲液，4层纱布过滤，所得滤渣，按照1:4比例加入含1％w/v吐温80，1mol/L NaCl提取滤渣中的结合态过氧化物酶；室温下搅拌提取2-5h，在4℃12000g条件下，离心20min，所得酶液置于4℃冰箱冷藏待用；

步骤二，酶液在搅动中缓慢加入试剂使形成14％PEG(W/V)-10％(NH4)2SO4W/V体系，充分搅拌至溶解。转移至分液漏斗中静置萃取2h，取下相，即为粗酶液；

步骤三，移取缓冲溶液，控制反应体系温度为20～60℃，pH值为3～11，加入适量粗酶液，加入BPA使反应体系中BPA浓度为0.2mmol/L，加入摩尔浓度为BPA 0.2～5倍的H2O2启动反应，反应时间为180min；于反应开始1min、3min、5min、15min、45min、90min、120min、180min从上述反应体系中取样1ml，加入2mL甲醇终止反应，即实现深山含笑叶片粗酶液对BPA的降解；在终止反应液里加入适量明矾，摇匀，过夜沉淀后5000g离心10min。离心后的上清液过0.22μm滤膜后，采用液相色谱—质谱联用仪检测，流动相为80％甲醇/水，质谱检测准分子离子峰对应的相对分子质量为228.3。

进一步，所述步骤一深山含笑叶提取液中为有聚乙烯吡咯烷酮、乙二胺四乙酸的柠檬酸—磷酸缓冲液交联聚乙烯吡咯烷酮粉末。

进一步，所述步骤一缓冲溶液为醋酸—醋酸钠缓冲溶液、硼砂缓冲溶液、柠檬酸—磷酸缓冲液中的任一种，浓度均为50mmol/L。

进一步，所述pH值为7。

进一步，所述BPA初始浓度为0.2mmol/L。

进一步，所述温度为室温。

进一步，所述反应时问为180min。

进一步，所述酶加入量为15U/mL。

本发明根据过氧化物酶催化酚类物质氧化反应原理，采用人工加入氧化剂过氧化氢，由过氧化物酶催化清除有机物BPA，提出一种应用深山含笑叶片粗酶液降解BPA的方法。深山含笑作为中国特有的园林观赏物种，资源丰富，其叶片比较容易获得。酶促反应具有催化效率高、反应条件温和、可调节性等特点，应用深山含笑叶片粗酶液可以大大提高BPA的降解效果，同时其对于其他的一些内分泌干扰物(如苯胺类、酮类、醇类等)也有非常好的清除效果，具有成本低、绿色、安全、无污染的优良特性。本方法采用的是植物过氧化物酶催化氧化法降解BPA，降解效率高，且所采用的原料深山含笑叶片易获得，具有高效、绿色、无二次汚染、成本低的优点；且能够充分利用园林观赏植物大量春季新旧叶更替过程中即将凋落的深山含笑叶片，提高深山含笑种植的综合经济效益。

附图说明

图1是本发明实施例提供的利用深山含笑叶粗酶液清除双酚A的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的不同酶浓度下BPA的清除情况示意图。

图3是本发明实施例提供的不同温度条件下BPA在3小时内BPA剩余率示意图。

图4是本发明实施例提供的不同pH条件下BPA在3小时内剩余率示意图。

图5是本发明实施例提供的不同BPA与过氧化氢摩尔浓度比条件下BPA在3小时内剩余率示意图。

图6是本发明实施例提供的不同浓度富里酸条件下BPA在3小时内剩余率示意图。

图7是本发明实施例提供的不同浓度腐植酸条件下BPA在3小时内剩余率示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的利用深山含笑叶粗酶液清除双酚A的方法包括以下步骤：

S101：称取成熟深山含笑树叶，按1:50比例加入不溶性交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，在液氮中迅速研磨，再按照1:5比例加入含10％聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)和2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸缓冲液(50mmol/L，pH 7.8)，4层纱布过滤，所得滤渣，按照1:4比例加入含1％(w/v)吐温80，1mol/L NaCl提取滤渣中的结合态过氧化物酶。室温下搅拌提取2-5h，在4℃12000g条件下，离心20min，所得酶液置于4℃冰箱冷藏待用；

S102：酶液在搅动中缓慢加入试剂使形成14％PEG(W/V)-10％(NH4)2SO4(W/V)体系，充分搅拌至溶解。转移至分液漏斗中静置萃取2h，取下相(盐相)，即为粗酶液；

S103：移取缓冲溶液，控制反应体系温度为20～60℃，pH值为3～11，加入适量粗酶液，加入BPA使反应体系中BPA浓度为0.2mmol/L，加入摩尔浓度为BPA 0.2～5倍的H2O2启动反应，反应时间为180min。于反应开始1min、3min、5min、15min、45min、90min、120min、180min从上述反应体系中取样1ml，加入2mL甲醇终止反应，即实现深山含笑叶片粗酶液对BPA的降解。在终止反应液里加入适量明矾，摇匀，过夜沉淀后5000g离心10min。离心后的上清液过0.22μm滤膜后，采用液相色谱—质谱联用仪检测，流动相为80％甲醇/水，质谱检测准分子离子峰对应的相对分子质量为228.3。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

实施例1 深山含笑叶片粗酶液不同酶浓度对BPA降解的影响。

每个反应体系分别放置于3只编号的试剂瓶中，总共3只试剂瓶，每个试剂瓶中加入pH值为7的磷酸—柠檬酸缓冲液、再加入BPA使得终浓度为0.2mmol/L、然后分别加入含有不同酶活性的酶液100U、200U、300U，反应体系共20mL，取1mL样加入1mL甲醇作为空白对照，向其中加入干净的磁力搅拌石。将试剂瓶分别置于恒温水浴锅中常温下搅拌，按照过氧化氢与BPA摩尔浓度比为1：2加入过氧化氢溶液反应180min，于反应1min、3min、5min、15min、45min、90min、120min、180min取1mL反应混合液，加入1mL甲醇终止反应，即实现深山含笑叶片粗酶液对BPA的降解。在终止反应液里加入适量明矾，摇匀，过夜沉淀后5000g离心10min。离心后的上清液样品取出过0.22μm有机滤膜后在液相—质谱联用仪上检测，质谱检测峰对应的相对分子质量约为287.03，流动相为45％乙腈/水。得到的具体结果如图2所示，从图中可以看出，当反应体系酶浓度为15U/ml时，BPA降解率最高，为100％，低于此酶浓度均不能完全清除。

实施例2 不同温度条件对深山含笑叶片粗酶液降解BPA的影响。

取5只试剂瓶，每个试剂瓶中加入pH值为7的磷酸—柠檬酸缓冲液适量，再加入BPA溶液，使终浓度为0.2mmol/L，然后加入一定量酶液，使酶活性单位达到15U/mL，保持总体积为20mL(不足部分，以pH值为7的磷酸—柠檬酸缓冲液补充)，混匀，取1mL混合液，加入1mL甲醇作为空白对照，在混合液中加入磁力搅拌子。将试剂瓶分别置于水温为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃的恒温磁力搅拌水浴锅中搅拌，按照过氧化氢与BPA摩尔浓度比为1：2加入过氧化氢溶液，反应180min，于反应1min、3min、5min、15min、45min、90min、120min、180min从反应混合液中分别取1mL样，加入1mL甲醇终止反应，即实现深山含笑叶片粗酶液对BPA的降解。得到的具体结果如图3所示，从图中可以看出，当温度在20℃～60℃范围时，经过3小时反应，BPA含量逐渐下降，在30℃～40℃范围内清除率可达90％以上，具有良好的温度适应范围。

实施例3 pH对深山含笑叶片粗酶液降解BPA的影响。

每个反应体系分别放置于9只编号的试剂瓶中，总共9只试剂瓶，用醋酸—醋酸钠、磷酸—柠檬酸、硼砂缓冲液控制反应体系pH值为3、、4、5、6、7、8、9、10、11，再加入BPA溶液，使终浓度为0.2mmol/L，然后加入酶液，使酶活性单位达到15U/mL，保持总体积为20mL(不足部分，以pH值为7的缓冲液补充)，取1mL样，加入1mL甲醇作为空白对照，向其中加入干净的磁力搅拌石。将试剂瓶分别置于磁力搅拌器中在常温下进行反应，按照过氧化氢与BPA摩尔浓度比为1：2加入过氧化氢启动反应，于反应1min、3min、5min、15min、45min、90min、120min、180min分别取1mL反应混合液，加入1mL甲醇终止反应，即实现深山含笑叶片粗酶液对BPA的降解。得到的结果具体如图4所示，从图中可以看出，在pH值为3～7范围内，BPA清除率可达90％以上，在碱性范围内清除率随pH升高而降低，由此可见，深山含笑过氧化物酶在酸性pH范围内具有较宽的pH阈值，在污水处理下游易于应用。

实施例4 不同BPA与过氧化氢摩尔浓度比条件下BPA在3小时内剩余率。

每个反应体系分别放置于6只编号的试剂瓶中，总共6只试剂瓶，每个试剂瓶中加入pH值为7的磷酸—柠檬酸缓冲液、再加入BPA溶液，使终浓度为0.2mmol/L，然后加入酶液，使酶活性单位达到15U/mL，保持总体积为20mL(不足部分，以pH值为7的缓冲液补充)共20mL，取1mL混合液加入1mL甲醇作为空白对照，向其中加入干净的磁力搅拌石。按照过氧化氢与BPA摩尔浓度比为1：0.2、1：0.5、1：0.8、1：1.2、1：2、1:5加入过氧化氢溶液常温下反应180min，于反应1min、3min、5min、15min、45min、90min、120min、180min分别取1mL反应混合液，加入1mL甲醇终止反应，即实现深山含笑叶片粗酶液对BPA的降解。得到的具体结果如图5所示，从图中可以看出，当过氧化氢与BPA摩尔浓度比为1：0.2～1：2范围时，BPA清除率可达95％以上，当H2O2/BPA浓度比值达到5倍时，1min内BPA清除率达到55.4％，随后BPA清除速率下降，3h后BPA清除率为76.7％，说明高浓度H2O2抑制酶活性，测定反应后的剩余酶活也说明了这一点。

实施例5 不同浓度富里酸条件下BPA在3小时内剩余率

每个反应体系分别放置于8只编号的试剂瓶中，总共8只试剂瓶，每个试剂瓶中加入pH值为7的磷酸—柠檬酸缓冲液、再加入BPA溶液，使终浓度为0.2mmol/L，然后加入酶液，使酶活性单位达到15U/mL，最后加入富里酸溶液，使反应体系中富里酸浓度分别为0mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L,反应混合液共20mL，取1mL混合液，加入1mL甲醇作为空白对照，向其中加入干净的磁力搅拌子。按照过氧化氢与BPA摩尔浓度比为1:2加入过氧化氢溶液，常温下反应180min，于反应1min、3min、5min、15min、45min、90min、120min、180min分别取反应混合液1mL，加入1mL甲醇终止反应，即实现深山含笑叶片粗酶液对BPA的降解。得到的具体结果如图6所示，从图中可以看出，不同浓度的富里酸溶液对于清除BPA的速率影响不同，当富里酸浓度高于50mg/L时，BPA清除反应速率变慢，180min后最终清除率降低，高浓度的富里酸能够显著影响过氧化物酶的活性；当富里酸浓度低于50mg/L时，能够加快酶清除BPA的反应速率，但180min后，BPA清除率并无明显差别，均可达到99％以上。

实施例6不同浓度腐殖酸条件下BPA在3小时内剩余率

每个反应体系分别放置于8只编号的试剂瓶中，总共8只试剂瓶，每个试剂瓶中加入pH值为7的磷酸—柠檬酸缓冲液、再加入BPA溶液，使终浓度为0.2mmol/L，然后加入酶液，使酶活性单位达到15U/mL，最后加入腐殖酸溶液，反应体系中腐殖酸浓度分别为0mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L，反应混合液共20mL，取1mL混合液，加入1mL甲醇作为空白对照，向其中加入干净的磁力搅拌子。按照过氧化氢与BPA摩尔浓度比为1:2加入过氧化氢溶液，常温下反应180min，于反应1min、3min、5min、15min、45min、90min、120min、180min分别取1mL反应混合液，加入1mL甲醇终止反应，即实现深山含笑叶片粗酶液对BPA的降解。得到的具体结果如图7所示，从图中可以看出，不同浓度的腐殖酸溶液对于清除BPA的速率影响不同，当腐殖酸浓度高于50mg/L时，BPA清除反应速率变慢，180min后最终清除率降低，高浓度的腐殖酸能够显著影响过氧化物酶的活性；当腐殖酸浓度低于50mg/L时，能够加快酶清除BPA的反应速率，但180min后，BPA清除率并无明显差别，均可达到99％以上。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。