一种石油烃污染土壤的微生物修复方法与流程

本发明属于对污染土壤的修复技术领域，特别涉及一种石油烃污染土壤的微生物修复方法。

背景技术：

随着科技的进步，机动车的使用量不断增加，不管是市区还是城镇的马路上，机动车的加油站随处可见。为了安全起见，该加油站中汽油、柴油的储油罐以及输油管通常埋设于地下。随着埋设时间的增加，储油罐以及输油管会出现破损渗漏的现象，进而导致其周边的土壤则受到一定的污染。

目前，国内外对污油泥处理的方法有：溶剂萃取法，热洗剂法，固化法，热解法，生物法(原位、异位)。其中溶剂萃取法和热洗涤法能耗大成本高，固化法容易造成二次污染，热接法可针对一些可回收原油的含油污泥。微生物技术以其独特的优势得到了国内外专家的广泛认同，是传统生物处理方法的延伸，具有治理面积大、不造成二次污染、费用低廉、形式多样灵活、不破坏土壤结构等优点。

经大量研究表明，石油烃的生物降解性因其所含烃分子的类型和大小而异。链长度中等(C10-C24)的石油烃最易降解；短链石油烃通常对许多微生物有毒，使得微生物难以对其进行降解。加油站附近的污染土壤中，柴油和汽油是主要污染物。其中柴油是复杂烃类(C10-C22)混合物，汽油的主要成分为C5-C12脂肪烃和环烷烃类，当土壤中同时含有柴油和汽油时，微生物难以在该土壤中较好的进行繁殖，进而使得微生物对该石油烃污染土壤的修复效果较差。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种石油烃污染土壤的微生物修复方法，微生物能够在同时含有柴油和汽油的污染土壤中大量繁殖，具有良好的土壤修复效果。

为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种石油烃污染土壤的微生物修复方法，包括以下步骤：

①、土壤采集

采集加油站附近不同深度处的污染土壤混匀，即为样品，待其风干后粉碎、去杂、过20目筛后混匀，得到土壤粉末；

取1g步骤①的土壤粉末平铺于分别以柴油和汽油为碳源的分离培养基上，将该分离培养基置于30-36℃培养箱内培养96h后，对应柴油降解菌落和汽油降解菌落；

③、菌种扩增

分别挑取步骤②中分离培养基上的柴油降解菌落和汽油降解菌落，将挑取的柴油降解菌落接种至以柴油为碳源的液体培养基中，同时将挑取的汽油降解菌落接种至以汽油为碳源的液体培养基中，再将该两种液体培养基置于摇床上，于30-36℃、150r/min培养7d，获得活菌数为1.5×10⁹-2.0×10⁹个/L的柴油降解菌种培养液和汽油降解菌种培养液；

④、菌种复配

将步骤③培养所得的柴油降解菌种培养液和汽油降解菌种培养液按1:1的重量比进行复配，得到复合菌种培养液；

⑤、菌种修复

采集加油站附近的污染土壤，将步骤④得到的复合菌种培养液投放至该污染土壤中，投放量为每1m³的土壤投放1L的菌种液，翻动土壤至菌种培养液分散均匀后堆成堆状，室温下保持土壤含水量为20-30％，定期搅拌通气。

通过采用上述技术方案，本发明收集需要修复的加油站附近的土壤，使用分离培养基分别筛选出能够分解柴油和汽油的菌种，再使用液体培养基增加菌种量，最后直接将制得的菌种培养液投放至对应的加油站附近的土壤中。以此，从需要修复的土壤中筛选出菌种能够较好的适应该土壤的环境而大量繁殖，以此能够快速有效的对柴油和汽油加以分解，对应生成对环境无污染的二氧化碳和水，具有良好的土壤修复效果。

进一步地，步骤②中，所述分离培养基的组分按重量份数计，包括牛肉膏0.5-1份、蛋白胨0.5-1份、NaCl 3-5份，琼脂20-25份，抗真菌剂0.01-0.03份、柴油或汽油1-2份、生物表面活性剂2-5份、蒸馏水1000份。

通过采用上述技术方案，分离培养基中的牛肉膏和蛋白胨作为菌种的营养成分，抗真菌剂能够对土壤中存在的真菌和放线菌加以抑制，NaCl用于调节菌种繁殖的渗透压，琼脂能够促使分离培养基呈固态，便于菌种的分离；生物表面活性剂促使柴油和汽油较好的分散于蒸馏水中。以此，能够分解柴油或汽油的菌种先分解牛肉膏和蛋白胨进行一定量的繁殖；待该菌种繁殖至一定量后，牛肉膏和蛋白胨的养分不足以满足菌种的繁殖所需，难以分解柴油或汽油的菌种因缺乏营养物质而凋亡，从而筛选出能够分解柴油或汽油的菌种，对被柴油和汽油污染的土壤具有良好的修复效果和环境友好性。

进一步地，步骤②中，所述抗真菌剂为放线菌酮与制霉素的混合物。

进一步地，步骤②中，所述放线菌酮与制霉素的重量比为1:1。

通过采用上述技术方案，放线菌酮是放线菌发酵产生的一种抗生素，对酵母、美军、原虫等病原菌等有抑制作用，对细菌无显著抑制作用；制霉素是多烯类抗真菌药，其可与真菌细胞膜上的甾醇相结合，致细胞膜通透性的改变，以致重要细胞内容物流失而发挥抗真菌作用。当放线菌酮和制霉素同时使用且重量比1:1时，能够增加制霉素的稳定性，其筛选出来的菌种能够快速有效的对土壤中的柴油和汽油加以分解，具有良好的特异性。

进一步地，步骤②中，所述生物表面活性剂为槐糖脂。

通过采用上述技术方案，槐糖脂是一种糖脂类生物表面活性剂，能够较好的促使柴油和汽油较好的分散于蒸馏水中，便于菌种均匀分布生长。其由于具有无毒、100％可生物降解、耐高温、耐高盐以及对环境友好等的特性，因此对菌种的伤害较小，在一定程度上还能作为菌种的营养成分，供菌种生长所需。相对于其他生物表面活性剂，其对应筛选的菌种具有更好的降解效果。

进一步地，步骤②中，所述分离培养基的制备方法为：按设定的重量份称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、生物表面活性剂、柴油、汽油和蒸馏水于锥形瓶中，搅拌至各组分均匀分散，121℃灭菌20min后，冷却至50-60℃加入抗真菌剂混匀，均匀分装至培养皿中，冷却至凝固即得。

通过采用上述技术方案，分离培养基在制备过程中先将组分均匀分散后再进行高温灭菌处理，以此减少组分发生结块、沉淀等状况，灭菌处理能够消灭培养基中原有的微生物，减少微生物之间为生存引起的竞争现象，有助于分离培养基更好的进行菌种筛选。抗真菌剂在灭菌后加入，以此降低其受热受压发生分解，保证其良好的抗真菌性能。

进一步地，步骤③中，所述液体培养基的组分按重量份数计，包括蛋白胨1-3份、酵母浸膏3-5份、葡萄糖1-2份，柴油或汽油1-2份、生物表面活性剂2-5份、蒸馏水1000份。

进一步地，步骤③中，所述生物活性剂为槐糖脂。

通过采用上述技术方案，蛋白胨、酵母浸膏和葡萄糖为菌种扩大培养提供充足的养分，有助于菌种快速进行繁殖，柴油和汽油为菌种提供生长所需碳源的基础上，还保证了菌种的环境适应性，使得扩增的菌种能够较好的适用于对应需要修复的土壤中。使用该液体培养基能够对所需的菌种加以快速扩增，具有组分简单、扩增效果优良的特点。

进一步地，步骤③中，所述液体培养基的制备方法为：按设定的重量份称取液体培养基的各组分于锥形瓶中，搅拌至各组分均匀分散，121℃灭菌20min，冷却后即得。

通过采用上述技术方案，液体培养基在制备过程中先将组分均匀分散后再进行高温灭菌处理，以此减少组分发生结块、沉淀等状况，灭菌处理能够消灭培养基中原有的微生物，减少微生物之间为生存引起的竞争现象，有助于液体培养基更好的进行菌种扩增。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过采集需修复的土壤、从该土壤中筛选所需的修复菌种、扩大培养该菌种以及投放菌种的方法，能够快速有效的对柴油和汽油加以分解，对应生成对环境无污染的二氧化碳和水，具有良好的土壤修复效果和环境友好性；

2、本发明选用自制的分离培养基和液体培养基，其对应删选和扩增的菌种能够快速有效的对土壤中的柴油和汽油加以降解，具有组分简单、效果优良的特点。

附图说明

图1为微生物修复石油烃污染土壤的总体操作工艺图。

图2为微生物修复石油烃污染土壤的细节操作工艺图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明。

1、材料及仪器本发明的试剂均为市售的化学纯。

1M NaOH溶液：由4gNaOH溶解于100mL蒸馏水中配制而成。

1M HCl溶液：由8.77mL质量百分数为38％的浓盐酸溶解于100mL蒸馏水中配制而成。

培养箱：购自上海赫田科学仪器有限公司，型号为250A。

摇床：购自上海赫田科学仪器有限公司，型号为HT-211系列。

高压灭菌锅：购自徐州淮博仪器设备有限公司，型号为LDZH-200KBS。

无菌操作台：购自上海赫田科学仪器有限公司，型号为SW-CJ-2D(2G)。

2、实施例

2.1、分离培养基的准备

a、称量：

柴油降解菌落培养基：牛肉膏0.5-1份、蛋白胨0.5-1份、NaCl 3-5份，琼脂20-25份，抗真菌剂0.01-0.03份、柴油1-2份、生物表面活性剂2-5份、蒸馏水1000份。

汽油降解菌落培养基：牛肉膏0.5-1份、蛋白胨0.5-1份、NaCl 3-5份，琼脂20-25份，抗真菌剂0.01-0.03份、汽油1-2份、生物表面活性剂2-5份、蒸馏水1000份。

b、溶解：取蒸馏水倒入锥形瓶中，依次加入将牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂充分混匀，再加入生物表面活性剂混匀，随后加入柴油或汽油，搅拌至各组分均匀分散，分别得到柴油混合液和汽油混合液。

c、灭菌：用棉塞以及牛皮纸对锥形瓶封口，放入高压灭菌锅中，在121℃的温度下灭菌20min。

d、分装保存：将灭菌完的锥形瓶连带混合液取出，放入无菌操作台中，开启紫外灯，待混合液冷却至50-60℃后，关闭紫外灯并开启通风程序，用酒精消毒抗真菌剂包装瓶后同操作人员带入无菌操作台，将抗真菌剂加入至柴油混合液或汽油混合液中，均匀分装至空培养皿，冷却至凝固即得柴油分离培养基和汽油分离培养基，经保鲜膜密封包装后置于4℃保存。

2.2、液体培养基的准备

a、称量：

柴油降解菌种培养液：蛋白胨1-3份、酵母浸膏3-5份、葡萄糖1-2份，柴油1-2份、生物表面活性剂2-5份、蒸馏水1000份。

汽油降解菌种培养液：蛋白胨1-3份、酵母浸膏3-5份、葡萄糖1-2份，汽油1-2份、生物表面活性剂2-5份、蒸馏水1000份。

b、溶解：取蒸馏水倒入锥形瓶中，依次加入将蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖充分混匀，再加入生物表面活性剂混匀，随后加入柴油或汽油，搅拌至各组分均匀分散，得到柴油液体培养基和汽油液体培养基。

c、灭菌：用棉塞以及牛皮纸对锥形瓶封口，放入高压灭菌锅中，在121℃的温度下灭菌20min。

d、冷却保存：将灭完菌的装有柴油液体培养基或汽油液体培养基的锥形瓶取出，冷却至室温，于4℃保存。

2.3、一种石油烃污染土壤的微生物修复方法，参见图1和图2，包括以下步骤：

①、土壤采集

采集加油站附近10cm、50cm、1m、2m以及5m处的污染土壤混匀，即为样品，待其风干后粉碎、去杂、过20目筛后混匀，得到土壤粉末；

②、菌种筛选

取3g步骤①的土壤粉末平铺于分别以柴油和汽油为碳源的分离培养基上，将该分离培养基置于30-36℃培养箱内培养96h后，对应柴油降解菌落和汽油降解菌落；

分别挑取步骤②中分离培养基上的柴油降解菌落和汽油降解菌落，将挑取的柴油降解菌落接种至以柴油为碳源的液体培养基中，同时将挑取的汽油降解菌落接种至以汽油为碳源的液体培养基中，再将该两种液体培养基置于摇床上，于30-36℃、150r/min培养7d，获得活菌数为1.5×10⁹-2.0×10⁹个/L的柴油降解菌种培养液和汽油降解菌种培养液；

④、菌种复配

将步骤③培养所得的柴油降解菌种培养液和汽油降解菌种培养液按1:1的重量比进行复配，得到复合菌种培养液；

⑤、菌种修复

采集加油站附近的污染土壤，将步骤④得到的复合菌种培养液投放至该污染土壤中，投放量为每1m³的土壤投放1L的菌种液，翻动土壤至菌种培养液分散均匀后堆成堆状，室温下保持土壤含水量为20-30％，定期搅拌通气。

2.4、实施例1-实施例5

实施例1-实施例5均在2.1-2.3的方法基础上，对分离培养基的组分及含量、液体培养基的组分及含量、微生物修复方法的参数作出调整，具体调整情况见下表一。

表一实施例1-实施例5的参数调整情况

2.5、对比例对比例1：申请公布号为CN106734181A公开的石油污染土壤的微生物修复方法。

对比例2：申请公告号为CN101091957B公开的石油污染土壤的微生物修复方法。

3、修复结果本发明采集了5个不同地区、不同污染程度的加油站附近的污染土壤作为样品，作为5个平行实验以验证本发明的修复效果。

将上述5种样品分别按照实施例1-实施例6以及对比例1和对比例2的修复方法进行处理，分别测定污染土壤在修复第7天、第15天、第30天和第45天时的柴油减少量和汽油减少量。检测结果见下表二。

表二实施例1-实施例6以及对比例1和对比例2的修复结果

参见表二，将实施例1-实施例6的修复结果与分别与对比例1和对比例2的修复结果进行比较，可以得到，本发明在土壤修复第45天时便能降解＞80％的柴油和＞75％的汽油，而对比文件在土壤修复第45天时仅仅降解＞60％的柴油和＞45％的汽油。因此，本发明能够快速有效的对被柴油和汽油污染的土壤进行修复，具有修复周期短、修复效果优良、对环境友好的特点。

将实施例1-实施例3的修复结果分别与实施例4-实施例6的修复结果进行比较，可以得到，实施例1-实施例3在第30天便能降解＞80％的柴油以及＞75％的汽油，实施例4-实施例6需要在45天才能达到该降解效果。因此，实施例1-实施例3为优选实施例。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。