一种生物修复石油烃化合物污染的土壤方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及土壤修复领域，具体说，涉及一种生物修复石油烃化合物污染的土壤 方法及应用。
【背景技术】
[0002] 随着现代化工业的发展，土壤污染已逐渐成为全球性环境问题之一。尤其是采矿、 金属冶炼、石油开采及化工企业生产，对土壤污染最为严重。造成重金属、烃类化合物及各 种有毒盐类在土壤中含量过高，且在很长时期内难以靠自然分解消除干净。
[0003] 石油烃中含有大量对人体有害的物质，如苯系物、多环芳烃以及其他难降解有毒 有害物质。被石油烃污染的土壤不但直接对人体产生毒害作用，还导致粮食减产。
[0004] 石油烃疏水性强，难以从土壤上解吸下来，在土壤基质中释放速度缓慢，是持久性 的污染源。此外，这种较慢的质量传输速度，制约了微生物等对污染物的降解作用，给土壤 修复技术的应用带来了困难。
[0005] 我国勘探、开发的油气田共400多个，分布在全国25个省、市、自治区，油田区工作 范围近20万平方公里。据不完全统计，油田区内污染场地有20余万处，高浓度石油污染土 壤及油泥沙积存量逾200万吨。华北油田周围的很多农田由于原油污染而无法耕种，每年 都要支付大量资金作为对农民的赔偿；黄河水系年平均含油最高可达4. 82mg/L，辽河水系 年平均含油最高可达7. 68mg/L，明显地超过了国家三级地面水的标准（< 0. lmg/L);有的 地区甚至污染到地下水资源，如山东淄博地区地下水最高含油达到了 l〇〇mg/L以上，超过 国家标准（<〇· lmg/L) 1000倍以上。
[0006] 如何消除土壤的石油烃污染问题，已经成为刻不容缓的问题。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述现有技术问题，本发明的一个目的在于提供一种生物修复石油烃化 合物污染的土壤方法，所述方法包括在土壤中种植修复植物以及对土壤施加修复生物制 剂。
[0008] 本发明的另一目的在于提供所述修复植物及修复生物制剂联合在土壤修复中的 应用。
[0009] 为达上述目的，一方面，本发明提供了一种生物修复石油烃化合物污染的土壤 方法，所述方法包括在土壤中种植修复植物以及对土壤施加修复生物制剂，所述修复植 物为一年生黑麦草（Lolium multiflorum)、多年生黑麦草（Lolium perenne)、高羊茅草 (Festuca arundinacea)和草原禾本科作物中的一种或多种的组合；所述修复生物制剂至 少包括含有植物促生菌的菌液，所述菌液含有植物促生菌Pseudomonas cedrina UW3和 Pseudomonas putida UW4〇
[0010] 植物促生菌可以抑制植物中乙烯的产生，并合成有益的生长素，用以促进植物生 长。而本发明发现，植物促生菌还可以促进石油烃化合物污染的降解，以及植物根系对污染 物的吸收，甚至可以保护植物免受土壤中污染物的伤害。
[0011] 进一步的，本发明通过大量的实验，发现所选用的菌种与特定的植物具有良好的 协同效应，可以更高效的清除土壤中的石油烃化合物污染。
[0012] 其中本发明优选所述土壤为受到石油烃化合物污染的土壤。
[0013] 根据本发明所优选的实施方案，其中优选所述草原禾本科作用包括黑麦或小黑 麦。
[0014] 其中本发明的一年生黑麦草（Lolium multiflorum)、多年生黑麦草（Lolium perenne)、高羊茅草（Festuca arundinacea)和草原禾本科作物可商购获得，譬如可购自 www. aerc. com ；
[0015] 其中的 Pseudomonas cedrina UW3 和 Pseudomonas putida UW4 记载于中国专利 申请200810181327. 8中，本发明不再进行赘述。
[0016] 譬如，在菌液中，UW3和UW4的菌数比例为1:2~2:1。
[0017] 再譬如，所述修复生物制剂还包括复合载体材料，所述复合载体材料包括有机质、 腐殖酸、腐熟有机质、络合置换剂、包埋材料中任意两种或两种以上的组合；优选复合载体 材料和菌液的比例为植物促生菌的菌数至少〇. 2~2亿/每克复合载体材料；还优选以 复合载体材料的重量为100%为基准，所述的复合载体材料包括以下重量百分比的成分： 15~35%的有机质、12~32%的腐殖酸、12~32%的腐熟有机质、5~22%的络合置换剂 和0. 01~1%的包埋材料。
[0018] 根据本发明所优选的实施方案，其中所述方法还包括对土壤的预处理步骤。
[0019] 所述预处理步骤额可以为本领域所常规的预处理步骤，本发明优选的是：所述预 处理步骤包括土地平整、除石头、翻地、耙地、施肥和播种前准备中的一种或几种。
[0020] 根据本发明所优选的实施方案，其中所述方法还包括在种植修复植物后对土壤进 行灌溉、割除和施肥。
[0021] 根据本发明另一优选的实施方案，其中所述方法还包括在割除后将切割物从土壤 中清除。
[0022] 根据本发明所优选的实施方案，其中所述割除为在修复植物生长过程的第60-70 天第一次割除，以及以后每40-60天割除一次，每次割除后留茬10-12cm。
[0023] 其中更优选为在第60天第一次割除。
[0024] 根据本发明所优选的实施方案，其中所述切割可以按照上述切割间隔贯穿植物的 整个生长期；甚至可以在每次切割后对土壤取样进行监测，至土壤中盐碱含量降至预期水 平。
[0025] 根据本发明所优选的实施方案，其中所述修复植物的种植密度以种子数量计为 300-600 粒 /m2 〇
[0026] 根据本发明所优选的实施方案，所述对土壤施加修复生物制剂是将生物制剂对种 子进行包衣进行施加，和/或者直接将生物制剂施加至土壤中。
[0027] 根据本发明所优选的实施方案，所述对土壤施加修复生物制剂包括将修复生物制 剂通过对种子进行包衣的方式进行施加，其包括在种植修复植物前，对植物种子包衣修复 生物制剂。
[0028] 其中优选菌剂包衣量为按5~lOml/kg种子。
[0029] 其中更优选修复生物制剂包衣量以其中含有的植物促生菌计为1~2万细胞/ 粒。
[0030] 根据本发明另一优选的实施方案，所述修复生物制剂中还含有质量百分比浓度为 0.5%的甲基纤维素。
[0031] 根据本发明所优选的实施方案，所述种子包衣可以使用现有市售的种子包衣机。
[0032] 该菌剂的制备可以参照专利200810181327. 8的制备方法，其中具体为：
[0033] (1).取1克植物根际土壤，浸入50ml PAF提取溶液中，再置入250ml容器中；该 PAF提取溶液为含有朊间质蛋白胨、干酪素水解物、MgS04、K2HPOjP甘油的组合物溶液；
[0034] (2).将上述含有50ml PAF提取溶液的三角瓶在25±2°C下震荡；
[0035] (3).取Iml上述步骤（2)震荡后的PAF提取溶液，再溶入含有50ml PAF提取溶液 的250ml容器中，在25±2°C下，震荡；
[0036] (4).取Iml上述步骤（3)得到的PAF提取溶液，溶入含有50ml DF盐溶液的250ml 容器中，在25 ± 2°C下震荡；该DF盐溶液为含有磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、葡萄糖、 葡糖酸、柠檬酸、硫酸亚铁、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、三氧化钼和硫酸铵的溶液；
[0037] (5).取Iml上述步骤（4)得到的提取溶液，再溶入50ml不含有硫酸铵但含有 3. OmM 1-氨基环丙烷-1-羧酸的上述DF盐溶液的容器中，在25±2°C下震荡；
[0038] (6).取0.0 lml上述步骤（5)得到的提取溶液，接入含有0. 03mM ACC的DF盐的平 板凝胶培养基上，在30 ± 2 °C培养2-4天；
[0039] (7).取步骤（6)的培养基上生长的菌落，其为植物促生菌Pseudomonas cedrina UW3 和 Pseudomonas putida UW4 的菌种；
[0040] (8).取上述步骤7得到的菌种，接种在胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，在25±2°C温 度下培养震荡24小时，得到培养溶液；
[0041] (9).在4°C下离心步骤⑶的培养溶液；
[0042] (10).用DF液冲洗步骤（9)离心沉淀的细胞；该DF液的成分包括蔗糖、琥珀酸、 EDTA、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和氯化镁；
[0043] (11).在4°C下再离心步骤（10)得到的DF细胞溶液；
[0044] (12).用DF盐液溶解离心沉淀的细胞，加入3. OmM的ACC，得到含菌细胞DF盐溶 液；
[0045] (13).步骤（12)得到的含菌细胞DF盐溶液，在25±2°C下培养、震荡；
[0046] (14).在4°C离心步骤（13)得到的DF培养溶液，得到离心沉淀的细胞；
[0047] (15).用IOml DF盐液溶解步骤（13)得到的离心沉淀的细胞得到含菌细胞DF盐 溶液；
[0048] (16).将步骤（15)得到的含菌细胞DF盐溶液在28±2°C下接种发酵，得到工业发 酵后的植物促生菌的菌液；该植物促生菌的菌液中菌数达到20-30亿/ml。
[0049] 根据本发明所优选的实施方案，其中所述对土壤施加修复生物制剂是直接将修复 生物制剂施加至土壤中；
[0050] 其中优选所述修复生物制剂的施加为种肥，或口肥，或底肥施用，施加量为50~ 100公斤/亩。
[0051] 根据本发明所优选的实施方案，其中所述修复生物制剂的施加为50-100公斤/ 亩。
[0052] 另一方面，本发明还提供了所述修复植物及修复生物制剂联合在土壤修复中的应 用，所述修复植物为一年生黑麦草、多年生黑麦草、高羊茅草和草地早熟草原禾本科植物禾 本科作物中的一种或多种的组合；所述修复生物制剂至少包括含有植物促生菌的菌液，所 述菌液含有植物促生菌 Pseudomonas cedrina UW3 和 Pseudomonas putida UW4〇
[0053] 其中优选所述草原禾本科作用包括黑麦或小黑麦。
[0054] 其中本发明优选所述土壤修复为受到石油烃侵蚀的土壤。
[0055] 综上所述，本发明提供了一种生物修复石油烃化合物污染的土壤方法及应用。本 发明的方法具有如下优点：
[0056] (1)利用太阳能的绿色环保技术；
[0057] (2)适用性广泛，可适用于不同地区和不同气候条件；
[0058] (3)保持和恢复土壤的自然结构和物理，化学和生物学特征；
[0059] (4)成本低廉，