专利名称：转相温度乳液在发酵过程中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及按照PIT-方法制造的乳液在发酵过程中的应用。
在合成复杂的天然物质或其他有机化合物如抗生素时，人们越来越多地采用微生物学的方法。在微生物特别是有细菌或真菌参与的条件下就涉及到厌氧或需氧条件下的物质转换。就这些方法而论，各专业领域不同，界限也总是模糊不清，如所用的“生物转化”，有的用“生物转变”或“发酵”。在本申请范围内后者也是这种方法的用语，这时，将微生物主要是细菌用于转变或合成化学化合物的。
对于发酵过程的开发和优化来说，尤其是在其中微生物发生转变的反应介质，是具有意义的。一般地说，反应介质都是一种水性液体或水性分散体，特别影响到方法的收益和效率。微生物需要碳、氮和某些以结合形式存在的痕量元素如钙、铁、磷或锌作为养料，以便进行新陈代谢，尽量达到所要求的产物。此外，还要经常保持一定的多数是窄范围的温度和pH-范围。至于其他详情细节，请参阅W.克鲁格尔(Crueger)/A.克鲁格尔的教科书“生物工艺学-应用微生物学教程”，1984年第2版，R.Oldenbourg出版社出版。该书第5章专门论述了发酵技术的基础。因此，这一文献也属于本申请要公开的内容。作为微生物的养料，除能量丰富的糖类及其衍生物外，在许多方法中都添加天然的脂肪和油类，以及这类物质的衍生物，如甘油、甘油酯、脂肪酸或脂肪酯。当然培养基内不宜有任何内含物，而它对微生物的新陈代谢有负面影响。
从德国专利DE3738812A1中已知，一种用微生物制造α-Ω-二羧酸的方法，该方法使用热带假丝酵母(Candida tropicalis)的杆菌将十二烷酸甲酯转化为所要求的二羧酸。转化是在水性介质中，pH值为6.0，温度30℃下产生。除了给微生物供应能量的葡萄糖外，介质还含有作为乳化剂的乙氧基化的脱水山梨糖醇单油酸酯、酵母提取物、玉米浆以及无机的氮源和磷源。然后，给介质定量添加十二烷基酸甲酯。文献没有提到乳液的类型、它在发酵物中的生成或在其中给介质定量加入月桂酸甲酯。由欧洲专利EP0 535 939A1中已知，有一种制备Ω-9-多种不饱和脂肪酸的方法，其中，水性培养基中，适宜的微生物在有糖类存在作为能量供应者和有无机或有机的氮源，以及有脂肪酸甲酯存在下生产所要求的多种不饱和脂肪酸。
而且还有一些方法，其中只利用上述现有技术的脂肪物质作为能量供应者。这是特别具有经济效益的，因为这种脂肪物质通常比起糖、淀粉和类似的化合物，其价更低廉。帕克(Park)等人(帕克等人，“发酵与生物工程杂志”，第82卷，第2期，第183～186页，1996)曾经描述过一种发酵过程以制造太乐菌素(tglosin)，其中在一种水性介质中使用弗氏链霉菌株(Streptomycesfradiae)的微生物，作为唯一碳源的菜籽油的原始用量大约含60克/公升。
此外，在发酵过程中，介质或发酵汁内的含氧量起着决定性的作用。因此，氧在需氧过程中具有基质的作用。对各种方法是否能使富含氧的气相过渡到含有微生物的液相是关键。一个重要参数表示特异的交换表面，一般来说交换表面是间接地由氧的过渡系数kLa来确定的(请参阅克鲁格尔的参考文献，第5章，第71页)。通常通过搅动发酵汁可调节氧的供入至最佳，氧或空气和液体混合，使界面产生气体交换。通过强烈的搅动，有明显的机械能的供入，如帕克等人所实施的，但也能破坏部分培养基，而使此法的收率减少。除此以外，坏死的微生物本身继续裂解，通过所形成的裂解产物可以导致培养基的毒化，于是不可能经济地生产。在戈玛(Coma)和洛尔斯(Rols)的工作(G.戈玛，J.L.洛尔斯，“生物工艺通讯”，第13卷，第1期，第7～12页，1991)中知道，发酵过程中使用豆油制造抗生素时可改进氧的过渡系数kLa，在投入相同能量(搅动)的情况下，可提高全过程的收率。
本发明的任务是改进发酵过程，一方面使用廉价的碳源，另一方面要保证给微生物以充分供氧，而不通过搅动以使微生物有高的机械负担。必须寻找一个方法，把发酵过程中的机械能量减少到最低程度，而不致于降低收率。主要是即使减少能量投入，也能提高收率。
已发现，使用特别微小细粒的油悬浮于水(油/水)的乳液就可解决上述任务。
在最初实施方案中，在发酵过程中使用油/水的乳液时，要求其中乳液至少含有水、乳化剂及油相，而油相含有一种或多种选自下列的化合物a)脂肪酸烷基酯和/或b)植物源的甘油三酯，而且乳液是按照PIT方法制造，其液滴大小在50～400纳米的范围内。
已知，水包油(油/水)的乳液是用非离子化的乳化剂制造而且是稳定的，它在加热时通常能得到可逆的转相，也就是说在一定的温度范围内乳液型式可以从油/水转变为水/油(油包水的乳液)。在这种情况下，因为油是在外的连续相，乳液的传导性降至零。在温度提高时乳液在传导性最大和刚好降至为零之间的温度平均值称为转相温度(PIT)，而使用这种方法制造的乳液称为转相温度(PIT)乳液。
已知，PIT的情况与许多因素有关，例如与油成份的种类和相体积，乳化剂的亲水性和结构以及乳化剂系统的组成。
对转相温度乳液的细度来说，其制造方法十分重要。通常，水相和油相和乳化剂混合，然后加热到转相温度以上的温度。同时，传导性必须降至零。接着，乳液再被冷却到最初温度(通常室温，约20℃)。首先通过超越PIT并接着的低于PIT温度，就形成了按照本发明所用的乳液。
已知，只有这种PIT-乳液是特别微细的，它在转相的情况下使油和水或膜状流体结晶相之间形成一个具有界面张力低的微乳液相。因此，关键步骤总是在冷却时进行逆转。
德国专利DE38 19 193A1公开了一种使用相逆转技术以制造低粘度的油/水乳液的方法。这种技术在这里被用于混合物内，在水介质中含有油成份、非离子性乳化剂和一种助乳化剂。油的组成是由50～100(重量)％的特定的单酯及双酯，0～50(重量)％的C8-C22的脂肪酸甘油三酯，必要时可含有0～25(重量)％的烃油所组成。德国专利DE3819193A1所公开的除上述成份外没有提出任何其他组份，也没有提到所制乳液的应用目的。
从德国专利DE41 40 562A1中获悉一种按照PIT原理制造油/水乳液的方法，其中极性的油成份和乳化剂系统，该系统含有HLB值范围在10～18之间的非离子化乳化剂，在有由选自C12-22脂肪醇和/或格尔伯特(Guerbet)醇类构成的助乳化剂存在下，在超过乳液的PIT温度下进行加热，接着再冷却，这时就得到很细的乳液。
从德国专利DE196 35 553A1中得知一种制造微细颗粒的PIT-乳液的乳化剂系统，其中含有的主要成份为脂肪酸乙氧基化物和偏甘油酯。
按照本发明的乳液的特征特别是其细度。液滴大小为50～400纳米。优先的液滴大小为100～300纳米范围内，尤其是在180～300纳米范围内，特别优先的在160～250纳米的范围内。液滴的大小是按照高斯分布。其测定例如通过光的散射或吸收来进行。
小油滴的细度可使油相和水相之间产生很大的表面，同时可使含有微生物的水相和含有养料的油相之间能有如此迅速的接触。通过很大的表面也简化了气体的交换，特别是氧和CO2的交换。此外，乳液的粘度以及全部发酵介质的粘度也随之降低。
因此，可以明显地减少发酵介质的搅拌速度，从而提高发酵过程的收率。
按照本发明，是在含有微生物，必要时含有其他助剂和添加剂的水性发酵介质中定量添加PIT乳液的。这种方法的细节，特别是所加乳液的速度和量都由微生物的种类和所择的各种发酵方法所定，而专业人员是能够适应具体情况的。
PIT-乳液除含水以外还含有油相，油相是由脂肪酸烷基酯类a)或天然植物油类及其衍生物b)所构成的化合物。所涉及的a)类和b)类是疏水的，是不溶于水或很少溶于水的化合物，对发酵过程中所用的细菌而言，它们既可用作养料，又可用作能量供应者，而且它也作为原料，也是通过生物转换所要求的产物的基质。a)类适宜的酯特别是从有7至23个碳原子的饱和的、不饱和的、直链的或支链的脂肪酸中衍生的。并以式(I)表示的化合物R1-COO-R2(I)其中R1代表有6-22个碳原子的烷基，R2表示有1-4个碳原子的烷基，其中，甲基和乙基特别优先。使用甲酯是有利的。式(I)的甲酯可用通常方式而获得，如通过甘油三酯和甲醇的酯基转化，最后进行蒸馏。适宜的脂肪酸是己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一碳烷酸、月桂酸、十三碳烷酸、肉豆蔻酸、十五碳烷酸、棕榈酸、十七碳烷酸、硬脂酸、十九碳烷酸、花生酸和山萮酸。不饱和酸的代表有，例如，月桂烯酸、肉豆蔻烯酸、棕榈炔酸、岩芹烯酸、油酸、反油酸、蓖麻酸、亚油、反亚油酸、亚麻酸、顺-9-十二碳烯酸、花生四烯酸和芥酸。还有，这些酸的甲酯混合物也是适宜的。使用含有油酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯和/或壬酸甲酯类的甲酯的PIT-乳液是特别优先。基于天然脂肪酸混合物的甲酯，例如由亚麻子油、椰子油、棕榈油、棕榈仁油、橄榄油、蓖麻油、菜籽油、豆油或葵花油(菜籽油和葵花油有时有新和旧法栽培的品种)中获得的甲酯也可以使用。
b)类适宜的化合物是植物源的天然油类。因此主要涉及甘油三酯的混合物，其中甘油有时和长链脂肪酸可完全酯化。特别适宜的植物油则选自花生油、椰子油和/或葵花油。
花生油平均含有(基于脂肪酸)54(重量)％的油酸、24(重量)％的亚油酸、1(重量)％的亚麻酸、1(重量)％花生酸、10(重量)％的棕榈酸，以及4(重量)％的硬脂酸。熔点为2～3℃。
亚麻子油通常含有5(重量)％的棕榈酸、4(重量)％的硬脂酸、22(重量)％的油酸、17(重量)％的亚油酸和52(重量)％的亚麻酸。碘值位于155～205的范围内。皂化值为188～196，熔点大约为-20℃。
椰子油在脂肪酸中含有约0.2～1(重量)％的己酸、5～8(重量)％的辛酸、6～9(重量)％的癸酸、45～51(重量)％的月桂酸、16～19(重量)％的肉豆蔻酸、9～11(重量)％的棕榈酸、2～3(重量)％的硬脂酸、少于0.5(重量)％的山萮酸、8～10(重量)％的油酸以及至多1(重量)％的亚油酸。碘值位于7.5～9.5的范围内，皂化值为0.88～0.90。熔点20～23℃。
橄榄油主要含有油酸(请参阅Lebensmittelchem.Gerichtl.Chem.，39，112～114，1985)。棕榈油作为脂肪酸成份含有约2(重量)％的肉豆蔻酸、42(重量)％的棕榈酸、5(重量)％的硬脂酸、41(重量)％的油酸、10(重量)％的亚麻酸。棕榈仁油，基于脂肪酸光谱，通常含有下列成份9(重量)％的己酸/辛酸/癸酸，50(重量)％的月桂酸、15(重量)％的肉豆蔻酸、7(重量)％的棕榈酸、2(重量)％的硬脂酸、15(重量)％的油酸和1(重量)％的亚油酸。
菜籽油作为脂肪酸成份通常含有约48(重量)％的芥酸、15(重量)％的油酸、14(重量)％的亚油酸、8(重量)％的亚麻酸、5(重量)％的二十碳烯酸、3(重量)％的棕榈酸、2(重量)％的十六烯酸和1(重量)％的二十二烷二烯酸。用新法栽培的菜籽油是富含不饱和成份。通常脂肪酸组份是芥酸0.5(重量)％、油酸63(重量)％、亚油酸20(重量)％、亚麻酸9(重量)％、二十烯酸(Icosensaure)1(重量)％、棕榈酸4(重量)％、十六烯酸2(重量)％和二十二烷二烯酸1(重量)％。
蓖麻油含有80～85(重量)％的蓖麻酸的甘油酯，此外还含有约7(重量)％的油酸的甘油酯、3(重量)％的亚油酸的甘油酯以及大约2(重量)％的棕榈酸和硬脂酸的甘油酯。
豆油含有总脂肪酸的55～65(重量)％的多种不饱和酸，特别是亚油酸和亚麻酸。葵花油有类似的情形，基于总脂肪酸，通常的脂肪酸光谱如下约1(重量)％的肉豆蔻酸、3～10(重量)％的棕榈酸、14～65(重量)％的油酸和20～75(重量)％的亚油酸。
有关上述甘油三酯中脂肪酸成份的一切数据都是已知的，它依赖于原料的质量，因此在数值上可能有偏差。特别优先的是含有选自椰子油、葵花油和/或菜籽油类的b)类养料的PIT-乳液。
按照本发明，所用PIT-乳液的重要成份是加入乳化剂及乳化剂系统。首先作为乳化剂而加入的是非离子性乳化剂，特别是乙氧基化的脂族醇和脂肪酸。为了形成PIT乳液，加入两成份的乳化剂系统是有利的，即含有一个亲水性乳化剂(A)和一个疏水性助乳化剂(B)。作为亲水非离子性乳化剂(A)适宜的是HLB值约为8～18的物质。所谓HLB(亲水-亲脂-平衡)值应当理解为按下式计算的值HLB＝(100-L)/5其中L指亲脂类的重量组份，即脂族烷基类或脂族酰基类在环氧乙烷加成产物中的百分数。
按照本发明的含意，脂肪醇乙氧基化物具有以下通式(II)R3-O-(CH2CH2O)n-H (II)其中R3代表有6～24个碳原子的直链或支链的、饱和或不饱和的烷基，n表示1～50的数值。在式(II)中，特别优先的，是n值为1～35，尤其是1～15的化合物。此外，特别优先的是式(II)中R3是有16～22个碳原子的烷基的化合物。
公式(II)的化合物是按已知方法通过脂族醇同环氧乙烷，必要时有酸性或碱性催化剂存在下，在加压下转化而制得的。代表性的实例是己醇、辛醇、2-乙基己基醇、癸醇、月桂醇、异十三烷醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇、棕榈油醇、硬脂醇、异硬脂醇、油醇、反油醇、岩芹醇、亚油醇、亚麻醇、桐醇、花生醇、顺-9-二十碳烯醇、山萮醇、瓢儿菜醇和巴西烯醇以及其工业混合物，例如基于脂肪和油的工业甲酯的高压氢化时或由Roelen羰基合成醛时以及在不饱和脂肪族醇二聚作用中作为单体分馏时所产生的。优先的是有12～18个碳原子的工业脂族醇，例如椰子醇、棕榈醇、棕榈仁醇或硬脂醇。
脂肪酸乙氧基化物也可作为乳化剂成份(A)，主要是式(III)R4CO2(CH2CH2O)mH(III)
其中R4代表有12～22个碳原子的直链或支链的烷基，m为5～50的数值，优选是15～35。代表性实例是由20～30摩尔的环氧乙烷和月桂酸、异十三烷酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、异硬脂酸、油酸、反油酸、岩芹酸、亚油酸、亚麻酸、桐酸、花生酸、顺-9-二十碳烯酸、山萮酸和芥酸的加成产物以及其工业混合物，例如在天然脂肪和油加压裂解时或由Roelen羰基合成还原醛时产生的。优选是由20～30摩尔的环氧乙烷和有16～18个碳原子的脂肪酸的加成产物。
偏甘油酯可以考虑作为乳化剂成份(B)，优选是式(IV)化合物 其中COR5代表有12～22个碳原子的直链或支链的酰基，x、y和z的总和为0或者为1～50的数值，优选是15～35。适于本发明含意的偏甘油酯的代表性实例是甘油单月桂酸酯、甘油单椰子脂肪酸酯、甘油单棕榈酸酯、甘油单硬脂酸酯、甘油单异硬脂酸酯、甘油单油酸酯和甘油单牛脂酸酯以及其和5～50优选是20～30摩尔的环氧乙烷的加成产物。优选使用单酸甘油酯及工业的单酸-/二酸-甘油酯的混合物和过量式(IV)中的单酸甘油酯组份，其中COR5代表有16～18个碳原子的直链酰基。
通常使用的乳化剂混合物，其中(A)和(B)成份的重量比为10∶90至90∶10，优先是25∶75至75∶25，而特别优先的是40∶60至60∶40。
作为其他适宜的乳化剂，例如是选自以下的非离子性表面活性剂(I)2至30摩尔的环氧乙烷和/或0至5摩尔的氧化丙烯和有8～22个碳原子的直链脂族醇的加成产物；(II)有6～22个碳原子的饱和与不饱和脂肪酸的单甘油酯和二甘油酯以及脱水山梨糖醇单酯和脱水山梨糖醇二酯及其环氧化乙烷的加成产物；(III)烷基中有8～22个碳原子的烷基单苷和烷基寡苷及其乙氧基化的类似物；(IV)15～60摩尔的环氧乙烷和蓖麻油和/或硬化蓖麻油的加成产物；(V)聚油酯特别是聚甘油酯、例如聚甘油聚蓖麻油酸酯或聚甘油聚-12-羟基硬脂酸酯。由多种这类物质构成的化合物的混合物也是适合的；(VI)2～15摩尔的环氧乙烷和蓖麻油和/或硬化蓖麻油的加成产物；(VII)基于直链、支链、不饱和或饱和的C12/22-脂肪酸、蓖麻油酸以及12-羟基硬脂酸和甘油、聚甘油、季戊四醇、二季戊四醇、糖醇(例如山梨醇)以及聚苷(例如纤维素)的偏酯类；(VIII)羊毛蜡醇；(IX)聚亚烷二醇。
环氧乙烷和/或氧化丙烯和脂肪酸的单酸甘油酯和二酸甘油酯以及脱水山梨糖醇单酯和脱水山梨糖醇二酯或蓖麻油的加成产物，都是周知的并在商业上可市购的商品。因此而涉及到同系混合物，其平均烷氧化度相当于与其进行加成反应的环氧乙烷和/或氧化丙烯和基质物质量的比例。
为选择适宜的乳化剂系统，可以有目的地通过计算以求出各个系统的转相温度。但是，为优化起见，在选择乳化剂或乳化剂系统中还要另外考虑，对上述选择的工业处理的适应性以及，以一方为水相而另一方为油相的混合。相应的专业知识完全是另一个领域，特别是从化妆品制造领域发展的。特别值得参考的有TH.Forster、W.von Rybinski、H.Tesmann和A.Wadle在“国际化妆品科学杂志”上发表的“转相乳化作用的最佳乳化剂混合计算法”(16，84～92，1994)。在该文中详细阐述了对所给定的由一个油相、一个水相和一个乳化剂组合而成的三组份体系的计算方法，它基于转相温度(PIT)范围的对油相特征的EACN(相当于链烷烃的碳数)值通过CAPICO法(浓缩物中的转相计算)进行计算。Forster等人的公开，特别又包括了本文产生复杂主题的重要文献，使人们看到它与Forster等人出版物的公开有关。然后，在个别地方根据列举的实例说明如何在EACA概念的框架内使用CAPICO方法以选择和优化乳化剂/乳化剂系统，以便获得最佳调整转相温度范围的预定值。
本发明所用的PIT乳液主要含有水20～90(重量)％，尤其是30～80(重量)％，而最优先的则是30～60(重量)％。100重量份中的其余(重量)％是油相以及乳化剂，必要时还有其他助剂和添加剂。油相本身的优先量为10～80(重量)％，尤其是40～70(重量)％。此外，油相优选只含有a)或b)的成份或者是这些成份的混合物。特别优先的是使用乳液所含油相和水相的重量比例为1∶1时。乳化剂或乳化剂系统的优先含量是1～25(重量)％，尤其是含量为5～20而特别优先的含量是5～15(重量)％。本发明所用的乳液表明，优选的转相温度范围是20～95℃，特别是从40到95℃。
按照本发明，所描述的PIT-乳液可以用于各种发酵过程。此外还可用于专业人员所熟悉的所有的方法布置，如分批发酵法或分批加料发酵法，以及连续发酵法。凡是专业人员所熟悉的发酵系统也都可以使用。详细情况请参阅Crueger的著作，第50-70页。微乳的用途不限于某些微生物，专业人员通过发酵所熟悉的化合物，都可使用乳液进行制造或转换。除了以合成抗生素为主而采用的经典的发酵方法以外(请参阅，Crueger著作，第197～242页)，上述乳液还适用于微生物的转化(“生物转换”)，如甾族化合物和甾醇的转换、抗生素和杀虫剂的转换，或者维生素的制造(请参阅Crueger的著作，第254～273页)。而优选是用于发酵过程以制造抗生素，如头孢菌素、太乐菌素或红霉素。
在一般情况下，按适当方式定量供给含有微生物和氮源和微量元素，必要时还含有其他助剂，尤其是除泡剂的水状发酵汁以乳液。作为氮源例如可考虑胨、酵母提取物或麦芽提取物、玉米浆、尿素或卵磷脂。微量元素可采用无机盐的形式，例如硝酸钠或硝酸钾、硝酸胺、硫酸胺、硫酸铁等等。PIT乳液的另一个优点，就是它本身可以以其他添加物，除泡剂或氮源加入。
表1a
表1b
权利要求
1.油/水乳液的应用，乳液至少含有水、乳化剂以及油相，而油相含有选自以下的一个或多个化合物a)脂肪酸烷基酯和/或b)植物源的甘油三酯，其特征为，在发酵方法中乳液是按照PIT-方法制造，且其液滴大小为50～400nm。
2.按照权利要求1的应用，其特征为，油相作为成份含有a)脂肪酸甲酯。
3.按照权利要求1或2的应用，其特征为，所用乳液，其液滴的平均大小在100～300纳米的范围内，优选是180～300纳米，而最优先的则是160～250纳米。
4.按照权利要求1至3的应用，其特征为，所用乳液的含水量为20～90(重量)％，优先为30～80(重量)％，特别优先为30～60(重量)％。
5.按照权利要求1至4的应用，其特征为，所用乳液的油相含量为10～80(重量)％，优先的为40～70(重量)％。
6.按照权利要求1至5的应用，其特征为，所用乳液含有式(I)的脂肪酸甲酯R1-COO-R2(I)其中R1代表有6～22个碳原子的烷基，R2则表示甲基。
7.按照权利要求1至6的应用，其特征为，所用乳液，其油相中含有油酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯和/或壬酸甲酯。
8.按照权利要求1至7的应用，其特征为，所用乳液在油相中含有葵花油和/或菜籽油。
9.按照权利要求1至8的应用，其特征为，所用乳胶含有一个乳化剂系统，该系统含有HLB值为8～18的亲水乳化剂，并结合有疏水助乳化剂。
10.按照权利要求9的应用，其特征为，所用乳液的乳化剂系统，其亲水乳化剂和助乳化剂之间的量比是10∶90至90∶10。
11.按照权利要求1至10的应用，其特征为，所用乳化剂的量为1～25(重量)％，优选是5～20(重量)％，特别优选为5～15(重量)％。
全文摘要
本发明涉及在发酵过程中油/水乳液的应用,该乳液至少含有水、乳化剂以及一种油相,该油相含有选自以下的一种或多种化合物:a)脂肪酸烷基酯和/或b)植物源的甘油三酯,其中乳液是按照PIT－方法产生的,乳液液滴的平均大小在50～400纳米的范围内。
文档编号B01F17/34GK1351654SQ00808011
公开日2002年5月29日 申请日期2000年5月16日 优先权日1999年5月25日
发明者马赛厄斯·韦格纳, 让－皮埃尔·莫利托, 克里斯琴·德豪特, 贝努特·阿布里贝特, 本特·罗格 申请人:考格尼斯德国有限责任公司