专利名称：一种用于在芯片上监测细胞反应的装置和方法
技术领域：
本发明涉及在芯片上监测细胞反应的装置和方法，特别是与细胞的固定相关的装置和方法。本发明还涉及产生可控制的浓度梯度的装置和方法，特别是在细胞成纵列固定后，沿细胞排列方向形成的浓度梯度。
在芯片上实现细胞反应的监测，可以提高这类实验的自动化水平，简单重复进行大量实验。尽管如此，芯片上的细胞实验带来了很多技术挑战，包括细胞操作和浓度梯度的产生。
关于细胞操作，已经有很多在微流装置中进行细胞操作的相关报道。包括电驱动运送技术，通过局部缩小结构固定细胞，用堰结构或者栅格结构捕捉细胞，负双向电泳势阱限制细胞(nDEP)，以及固定单个细胞的笼结构。
为了避免哺乳动物细胞的扭曲变形，只能进行温和的流动操作，例如nDEP技术。在这一技术中，细胞漂浮在溶液中，不与任何芯片结构相接触。根据电极阵列结构的不同，可以控制交流电来完成隧道、对准器、笼和开关模式等不同功能。但是，有效地限制小颗粒(如细胞)只能在极低的流动速度(微升/小时)下进行，而且，制作和排列三维电极阵列需要复杂的操作。尽管这样，单个细胞的操作仍然是可行的，比如利用比较简单的限制结构可以固定单个的胚胎细胞。
微装置中的稀释过程包括反应物和缓冲液的加入以及随后的扩散混合。在某些稀释过程中，通过包含反应物和缓冲液的液流的不断分离、混合和重组，可以很快达到平衡。而另一些装置则可以在反应物达到平衡前的一个短的直通道中形成浓度梯度。
所述的两部分通道在多个区域并列延伸，在每个区域的两部分通道被沿管壁方向的水坝结构分开。
所述的装置用于在所述的两部分通道的第一部分在第一种液压的驱动下流动载有细胞的液流，其中所述的装置在比第一种液压小的第二种压力的驱动下，第二部分通道中流动液流。
所述的装置还包括供应反应物到所述的第一部分通道的装置，在所述通道中产生所述反应物浓度梯度，以及浓度梯度随通道中液流方向变化的装置。
所述的浓度梯度产生装置包括稀释所述的反应物的装置。其中产生稀释的装置包括至少一个稀释交点，在此交点稀释溶液通过至少一个其它通道进入所述的第一部分通道。通过在反应物流到所述的第一部分通道时，或者让缓冲液流到所述的第二部分通道，或者不流到所述的第二部分通道，以提供在第一和第二种稀释模式间转换的装置。
所述的装置在第一个位置提供第一个稀释交点，在第二个位置提供第二个稀释交点，所述的第一个位置在反应物所在的第一部分通道的上游位置，第二个位置在下游位置。
本发明中用于在芯片上进行细胞反应实验的装置可以在沿第一方向延伸的直线上固定多个活细胞的装置，给这些细胞提供反应物的装置，在所述的直线上形成上述反应物的浓度梯度的装置。
本发明中提供的装置可以产生反应试剂的浓度梯度用于芯片内的细胞反应实验。其中第一部分通道可以运送反应试剂，第二部分通道和第一部分通道相邻且相互间有流体流动。至少存在另外一条微通道给第一部分通道提供稀释缓冲液，同时可以选择是否利用第二部分通道提供稀释缓冲液。由于第二部分通道可以选择是否流动稀释缓冲液，因而存在两种不同的稀释模式。
本发明同时提供了一种在芯片上监测细胞反应的方法通过固定多列活细胞在沿第一部分通道流动方向的直线上，给固定的细胞提供反应试剂，并且使反应试剂沿固定的直线形成浓度梯度。
本发明还提供了关于在芯片上监测细胞反应的装置的固定细胞的方法在该装置中，第一部分和第二部分在部分位置相互并列，并且在并列位置的一部分由沿通道壁方向的水坝结构分开，溶液可以由水坝结构上方在两部分通道之间自由流动。在第一部分通道的流体中加入细胞并且给予第一个大小的压力，在第二部分通道中给予小于第一个压力的第二个压力。
关于在芯片上监测细胞反应的装置的本发明还提供了一种形成反应试剂浓度梯度的方法。在第一部分通道中加入反应试剂，选择性地给与第一部分通道相邻并相互间有溶液流动的第二部分通道加入缓冲液，这样可以在二者的相交位置给第一部分通道提供稀释剂。
图2(a)和(b)是流体流经固定细胞的图解。
图3(a)和(b)是在稀释过程中的流动情况的图解。
图4是在发明实物中固定的一列细胞的图解。
图5是在简单以及复杂操作模式下浓度梯度分布图。
图6是利用发明装置的实物进行ATP依赖的钙吸收实验的共聚焦显微镜监测图。
图7是图6中细胞的相对细胞荧光图。
图8是用于比较目的的用传统方法得到的ATP阈值浓度图。
图9(a)-(c)是根据发明装置的实物来模拟流体流动和浓度梯度的产生。
图10(a)和(b)显示简单和复杂的控制模式。
图11是显示等价电路模型。
图12(a)和(b)显示简单控制模式下的混合和扩散情况。
图13是发明实物中染料浓度梯度的荧光显微镜图。
图14(a)-(c)图解通过改变一个入口的液体压力对浓度梯度的影响。
图15图解扩散系数对浓度梯度的影响。
图16(a)-(c)图解了复杂控制模式下的浓度梯度。
图1所示的装置中有六个入口/出口(未显示)，它们和标记为CW/A(细胞消耗物/分析物(cell waste/analyte)的首字母缩略词)、CDW(稀释消耗复合物(complex dilution waste))、SDL(左侧的系列稀释(serial dilution left))、SDR(右侧的系列稀释(serial dilutionright))、C/AW(细胞/分析物消耗(cell/analyte waste))以及DA(剪短的衰减物(docking attenuator))的样品池相连。这些入口/出口以及与之相连的样品池的功能可以从下面关于细胞固定方式和浓度梯度产生的描述中清楚得到。
应该注意到，图1中的A、B、C三条虚线表示水坝结构，它们分开两个通道，但是由于其高度没有达到通道的整个深度，因而流体可以经过水坝结构的上方从一个通道流到另一个邻近的通道。而且，水坝结构平行于通道中液体流动的方向。在传统的垂直与通道中液体流动方向的水坝结构上固定的脆弱的哺乳动物细胞极易变形扭曲，如果在沿主流方向构建水坝结构，水坝结构与液流的主流方向平行，固定的细胞可以具有更高的活性。
具体的机制由图2(a)和(b)所示。水坝结构允许液体从上面流过但是细胞会被阻挡在水坝结构的一侧。细胞固定后通过水坝结构上面流过的水流会减小。在细胞上面的流体压力不会有明显增加，因为流体主要还是在主流方向流动。只有那些在通道壁附近流动(较低速度的流层)的细胞会在小的液压差异下被温和地固定在水坝结构上，其它细胞会沿主流方向流到废液池(CW/A)中。为了增加固定的效果，少量液体允许从水坝结构另一侧的Y通道流入，这可以减少X通道垂直于水坝结构的流动。参考图1，载有细胞的溶液从样品池C/AW中进入微流通道f，同时，用于减小压差的缓冲液从样品池DA中流入，与载有细胞的溶液沿同一方向流动(图1中由下往上)。在A、B、C三个水坝结构的位置，少量溶液会流到缓冲液中，确保细胞可以温和地固定在水坝结构一侧形成沿水坝结构成一条直线排列的三个细胞固定区域。当然，缓冲液中的液体压力要低于载有细胞的溶液中的液体压力，否则细胞不会被固定。但是也要足够大以适当调节细胞与水坝结构之间的作用力，保证细胞在的正常存活。在三个水坝结构的位置，细胞就象图2(a)和(b)所示那样固定并排成列。图4显示固定的细胞沿水坝结构形成三列，这将在下面详细说明。
参考图1，本发明的实物装置中有两条微流通道abc和def从上往下(文中所述的“上”、“下”、“向上”、“向下”、“左”、“右”等等都是参考图1中的布局，都是为了描述的方便而不能解释为有任何限制)在A、B、C三个区域通过水坝结构互相连接。在细胞固定的过程中，左侧的通道abc可以让载有细胞的流体从样品池C/AW流入收集废弃细胞的样品池CW/A中，而右侧的通道def可以流动用于减小压差的流体从样品池DA流到样品池CDW。
为了产生浓度梯度，和样品池SDL和SDR相连的稀释通道ghjl和gikl与通道abc以及通道def水平相交于两个稀释交点A和C(图1)。在通道abc和def的左侧，样品池SDL与通道g相连，并且分成h和i两个通道，这两个通道再与通道abc相交。在通道abc和def的另一侧，样品池SDR与通道l相连然后分成j、k两个通道，与通道h和i类似，通道j、k也与通道def通过水坝结构相互连接。因此，在通道a、d、h、j的交汇处A形成第一个稀释交点，在通道c、f、i、k的交汇处C形成第二个稀释交点。
在本发明的实物中，通过简单或者复杂的稀释模式可以产生不同的浓度梯度。不同模式的选择通过样品池中不同的液压水平决定的，这将在下面详细阐述。不管运用何种控制模式，通过两个连续的稀释过程都可以产生一定的浓度梯度。但是，就如下面所述的那样，复杂的控制模式可以产生更高的浓度梯度。通过简单或者复杂的控制模式，可以产生有效的浓度梯度，这些浓度梯度与固定在水坝结构上成直线排列的细胞沿同一方向。这些都将在下面详细说明。
现在参照图3，利用可见荧光染料，如arcidine orange(AO)作为样品形成浓度梯度，对浓度梯度的产生作更详尽的说明。简单和复杂控制模式的唯一区别在于第一个稀释点A位置上稀释模式的不同。如图3(a)所示，简单模式稀释与传统的T交叉的稀释方法很相似。样品AO从样品池CW/A进入通道a，缓冲液从样品池SDL进入通道g，然后流经通道h。另一部分缓冲液从样品池CDW进入通道d起平衡作用。样品和缓冲液在第一个稀释点汇流，并且在下游的b通道中扩散混合。结果，在下游的通道中形成浓度梯度。图3(b)表示复杂的稀释模式。在该模式中，从样品池CW/A流入的样品可以流入到样品池CDW中(在这种模式下是空的)。在这种模式下，结合来自样品池SDL和SDR的更大的液体压力，只有少量的样品分子(主要依赖扩散)可以进入下游的通道b与缓冲液混合。因而在下游通道中产生比简单模式高的浓度梯度。
尽管两种稀释模式只在第一个稀释点的稀释方式上有所不同，第二个稀释点也很有用处。因为加入第二个稀释点可以在A、B、C三个区域产生更大的浓度范围。
参照本发明适合进行的典型的实验，介绍发明的一个实用的实物。下面本发明的实物特别用于检测诱导HL60哺乳动物细胞钙吸收的ATP阈值浓度。
在该例子中，HL60细胞(白血病，前髓细胞)悬浮于0.5ml新配制的溶有聚醚F-127(终浓度1％)和Fluo3-AM(终浓度2微摩尔)的RPMI 1640中。在室温下静置30分钟后，细胞重新悬浮于Hank’s平衡盐溶液(HBSS)中，然后加入装置。
该例子所用的装置如图1所示，制作过程也如前文所述。在使用前，蚀刻好的石英板和PDMS盖板用机械方法结合在一起，在紫外光下面照射10分钟。通过毛细作用，在微通道中充满缓冲液，装置安全地固定在共聚焦显微镜操作平台上面。利用2-20微升自动进样器(HL进样器)加入不同的流体。Axiovert 100M共聚焦显微镜(Carl Zeiss)用来数据采集。采集沿装置上特殊直线的光电倍增管信号响应得到所需的数据。所有的荧光物质都采用488内米氩激光器激发。一个505-530纳米滤镜用于Fluo-3和AO荧光，而560内米滤镜用于溴乙啶(EB)。对于特定的荧光物质，在所用实验中扫描参数都相同。
在该例子中，首先要进行细胞存活试验，即确认在细胞固定程序后，有足够数量的活细胞被安全地固定在芯片中。然后要用可见荧光物质进行浓度梯度实验。当固定了足够数量的活细胞，确认了浓度梯度可以形成，就可以使用本发明的装置检测钙吸收的阈值浓度。然后把得到结果和用传统的系列稀释方法得到的结果加以比较。
在该装置的实物进行的实验中，使用了不同的关于六个样品池的液压控制程序(LLP)，参考下表的详细内容表1.液压控制程序(LLP)LLP 操作SDL CW/ACDWSER DAC/AWA 细胞固定2000 0 4 5(细胞)B AO/EB染色 1010(AO/EB)10100 0C1简单模式155(AO)5 150 0C2复杂模式205(AO)0 200 0D ATP实验 205(ATP) 0 200 0所有值的单位都是微升。
在细胞固定阶段，使用LLP A程序，载有细胞的流体通过样品池C/AW进入，而用于减小压差的流体从样品池DA进入。DA中的液压比C/WA中的液压稍低，因而在A、B、C三个水坝结构区域靠DA一侧的液压稍低，细胞可以温和地固定在这三个区域。为了确保固定后的哺乳动物细胞可以在芯片细胞实验前存活，AO/EB实验将在细胞固定后20分钟内进行，使用LLP B程序。如图4所示，大约80个HL60细胞沿一个水坝结构排列，在AO实验中有91％的细胞存活。活细胞(AO可染色)呈黄色而死细胞(Ao和EB均可染色)呈红色。
与细胞固定过程相似，可以通过LLP调节样品池的液体压力来操作样品的浓度。图5是两个AO(33微摩尔/升)的浓度梯度，一个是LLP C1程序产生的(简单模式)，另一个是LLP C2程序产生的(复杂模式，参考表1)。在简单模式的稀释中，样品在AB两点间稀释后的浓度是原始浓度的80％，而复杂模式在同一区域的稀释则达到15倍之多。通过简单调节LLP，可以在单一稀释交点上动态调节稀释的过程。
图4和图5证实根据本发明制成的装置可以操作哺乳动物细胞并将它们安全地固定在指定位置并保持高活性，同时确保形成反应物的浓度梯度。需要注意的是浓度梯度与成直线排列的固定细胞方向一致。这种方法具有显著的优点在单独一个实验中，直接由一张图片，可以得到一个浓度范围内的反应物对细胞的影响。
哺乳动物细胞HL60当环境中的ATP浓度高于一特定值时可以吸收胞外钙离子。可以诱导细胞进行胞外钙离子吸收的最小ATP浓度称为阈值浓度。在该例子中，利用本发明的实物，细胞固定和反应物浓度梯度结合在一起来决定ATP依赖的钙吸收的阈值浓度。
不同条件下芯片的荧光图如图6所示，大约有80个细胞沿水坝结构固定。沿细胞固定的直线的相应荧光强度如图7所示。在“控制”图和强度检测中，细胞的背景信号是由于HL60细胞内本身的钙离子造成的。
当2微摩尔/升浓度的ATP溶液加入CW/A样品池，在AB之间区域的细胞荧光信号比其它区域高3倍(图6和图7，2μM图)。ATP的阈值浓度因而可以认为存在于A区域。
用缓冲液清洗后，同一批HL60细胞将暴露在更高的ATP浓度下。利用同样的LLP控制，随着反应物浓度的增加，阈值浓度下移到下游通道。如图6和图7所示，当5微摩尔/升浓度的ATP溶液加入装置中，细胞的荧光强度在A和B区域都会增强。阈值浓度下移到B区域。用10微摩尔/升浓度的ATP溶液重复实验，在所有区域的钙离子相关的荧光都会激发(在A区域的荧光信号相对较弱是由于多次ATP刺激的减敏现象)。
上述实验结果表明ATP阈值浓度小于2微摩尔/升。为了得到该实验中的阈值浓度，沿水坝结构的ATP浓度梯度需要估计。
与很多其它低雷诺数的微流系统相似，在本发明的微流通道网络中流动是层流的并且遵从Bernoulli方程式H＝hf＝λLv2/2dg (1)此处H表示液面高度，λ表示流阻系数，L表示微流通道的长度，v表示流动速度，d表示微流通道的水力直径，g表示重力加速度。利用该方程，可以求得液面高度H和流量Q之间的关系H＝RQ+KQ2(2)这里参数R和K依赖与微流通道的几何形状。对于该实物装置，式(2)中的第二项远远小于第一项，因而可以忽略不计。由此式(2)可以简化为H＝RQ (3)在本发明装置中的稀释应该计算反应物的扩散。下面的表达式可以用来计算层流混合后的浓度分配C(t,x)=12C0Σn=-∞∞{erfh+2nw-x2Dt+erfh-2nw+x2Dt}---(4)]]>在该等式中C(t，x)是在t时刻和x点的浓度，D是扩散系数(对ATP来说，D＝3.6×10-6cm2/s)，t是时间，l是通道的宽度，h是最初的浓度分布宽度，CO初始浓度。关于此发明装置的机械模型和计算通道中反应物浓度的一种可能途径将在下面详细说明。
沿水坝结构的ATP浓度梯度可以根据上面的计算模型估计。结合2微摩尔/升和5微摩尔/升ATP结果的模拟结果，浓度阈值估计在0.16±0.02微摩尔/升范围内。图8给出了的按传统方法，经过13个单独的系列稀释实验测定的浓度阈值。该浓度的阈值范围在0.15-0.19微摩尔/升之间，与本发明装置得到的结果十分吻合。
这里将举例说明产生已知浓度梯度的方法和如何计算浓度梯度。图9(a)是用于该实例的微流芯片。该芯片由石英基底和PDMS盖板构成，微流通道通过传统的照相平版术和蚀刻方法制作。简单来说，石英板先覆盖上一层感光材料，然后盖上掩膜，紫外光通过掩膜暴光。随后有机溶剂去掉暴光的感光材料，剩下具有高度化学抗性的聚合物。氢氟酸(HF)蚀刻掉暴露的石英的一部分，然后去掉剩下的感光材料就产生所需的通道结构。用金刚钻头在芯片上钻取一些3毫米直径的小孔作为流体的出口和入口。制作一个PDMS(Sylgard 184，DowCorning，Midland，MI)聚合物膜(2毫米厚)封闭微通道形成三明治结构。在每个实验之前，用洗涤剂清洗石英基底几次，在晾干后，在压力下用PDMS膜封闭微流通道。
0.01％的Acridine Orange(AO)溶于20毫摩尔/升TE缓冲液中。0.4％的Trypan Blue(TB)根据说明配制。所有的溶液都使用分析级的化学试剂配制，在使用前用孔径为0.25微米的滤膜(MFS25，ADVANTECMFS，Inc.)过滤。激光共聚焦显微镜(Axiovert 100M，Carl Zeiss)用于荧光图像检测。沿一条检测线的PMT信号作为检测数据。在AO实验中使用488纳米氩激光器和505-530纳米透射滤光片，同样的激光器和更长波的透射滤光片(585纳米)用于TB实验。对于特定的荧光物质，所有的扫描参数都保持不变。
如图9(b)所示，在简单的控制模式中，荧光染料溶液(AO或者TB)通过样品池CW/A进入微流通道，缓冲液通过样品池CDW、SDL和SDR进入微流通道，然后所有的流体都流入样品池C/AW和DA中。复杂模式中样品池CDW也成为出口，不在有缓冲液加入。整个芯片的图像由激光共聚焦显微镜捕捉，在A、B、C点形成的浓度梯度用轮廓图表示。
参考图9(a)，该实例所用的装置有六个出/入口，整个微流通道网络由沿中轴对称的两部分构成，并且由A、B、C三个水坝结构(图9(b)中的虚线部分，结构示意见图9(c))互相连接。不同的荧光染料溶液通过样品池CW/A进入微流通道，缓冲液通过样品池CDW、SDL和SDR进入微流通道。所有的溶液几乎同时加入微流芯片，从入口流向出口。两种控制模式，即先前介绍的简单和复杂控制模式，被用来操作流体压力。在简单的模式中(图10(a)，实线表示染料流，虚线表示缓冲液)，样品池CW/A与CDW，SDL与SDR的液面总是两两一致。因此，在对称面两侧不存在压力差异，也没有压力推动染料越过水坝结构进入另一侧通道，由通过水坝结构的极少量反应物可以忽略。因为对称通道之间的混合纯粹是通过扩散过程来完成的，由于水坝结构和盖板间的距离仅有5微米，大大小于通道的深度，因而在对称面两侧的溶液间只有很小的界面，这严重阻碍了对称通道间的溶液扩散。另外，溶液流经水坝结构的时间极短，也进一步降低了扩散量。所以，在简单控制模式中通过扩散越过水坝结构的染料分子极少。
在简单模式下，从CW/A样品池流入的染料与从SDL进入的缓冲液在A、C两个稀释交点混合。由于低流速(根据计算结果，小于100微米/秒)，在整个流动网络中流体的雷诺数很小，流动呈层流特性。(雷诺数Re是关于流体惯性力与粘性力比例关系的无量纲参数。通常把Re＜2000的流动视为层流。在此发明装置中，Re在10以下，因而满足层流条件)。在两个稀释交点混合后，根据层流特性，染料和缓冲液并列进入下游的通道中，两者的混合主要通过两种溶液间的分子扩散来完成。染料溶液在A、C两个交点经过两次稀释，因而在a、b、c三部分通道中染料的浓度各不相同，在通道的三个水坝结构位置产生了不连续的浓度梯度。
在复杂的控制模式中(图10(b))，染料溶液同样由CW/A样品池流入，只有SDL和SDR样品池流入缓冲液。在对称的两部分通道中产生了不平衡的流体压力。与简单模式不同的是，SDL样品池的液面较高，压力较大，染料溶液在A稀释交点不能继续进入下游的b通道，而必须穿越水坝结构进入d通道。而SDL样品池进入的缓冲液在A点分成两个部分，其中一部分进入下游的b通道，另一部分进入d通道。在A稀释交点，只有少量的染料分子可以扩散到进入b通道的缓冲液中，因而在b通道的染料溶液浓度大大低于简单模式下两种溶液混合产生的染料浓度。
下面将给出关于本发明装置浓度梯度产生的理论模型。
根据管道流动理论的Bernoulli方程H＝hf＝λLv2/2dg (5)此处H表示液面高度，λ表示流阻系数，L表示微流通道的长度，v表示流动速度，d表示微流通道的水力直径，g表示重力加速度(9.8米/平方秒)。L可以由通道长度l和流动阻力的等价长度le表示L＝l+le＝l+Σξid/λ (6)Σ表示求和符号，ξi表示损失系数，包括诸如各种接头，分流器，弯曲，扩大和缩小，阀等等对流动的影响。可以用雷诺数Re来代替流阻系数λλ＝64/Re＝64γ/vd (7)这里γ是运动粘度系数。速度v可以表示为流量Q与通道截面积A之比v＝Q/A(8)以上的等式从圆管流动理论得来的，它们也可以用来计算非圆管流动，只是式中的直径参数d要用非圆管的水力直径来代替。水力直径表示为d=4A/π---(9)]]>根据上面的(5)到(9)式，液面高度H与流量的关系Q可以表示为H＝RQ+KQ2，R＝128γl/gπd1；K＝8∑ξ/gπ2d1(10)R和K都是可以根据通道的几何尺寸计算得到的参数，关于本发明装置的相关参数参见表2。
表2.流动参数通道 水力直径d 通道长度 ΣξR(109s/m2) K(s2/m5)(μm) (μm)a，d，c，f35.44 28800.35156.8979 18429.5b，e 35.44 275 8.02 0.72476 420498h，i，j，k37.62 695 2.29551.44259 71130.6g，l 37.62 92800.095519.2623 2959.25从表2可以清楚地看出，在本发明装置中，参数K的绝对值比参数R的绝对值要小很多。而且在本发明的实验中，由于H较小，流量Q的数值也小于1，因而在等式(10)中KQ2远远小于RQ，可以忽略不计，从而使方程得以简化H＝RQ (11)该方程与电学中的欧姆方程非常相似，H可以看作电势差V，系数R可以看作电阻R，流量Q可以看作电流I。因吃，可以用一个等价的电流模型来模拟该流动网络(图11)。可以用电路分析中的数学方法来计算每个微通道中的流量大小，同时确定在每个稀释交点的混合参数。在简单的模式中，等式(11)可以用于装置左侧的六个通道(Hz＝RzQz，z从a到c，g到i)。同时，在各个通道的交点处都要满足流量平衡，从而产生由9个方程组成的方程组。在复杂的模式中，等式(11)被用于12个通道，加上4个交点的流量平衡方程，产生一个由16个方程组成的方程组。解这两个方程组得到在两种模式下各通道的流量大小以及染料和缓冲液在稀释交点位置的分配比例。
在层流情况下，当缓冲液和染料溶液进入稀释交点下游的同一通道的时候，扩散是两种溶液混合的主要机制。下面的数学表达式可以用来计算在通道中的浓度分布C(t,x)=12C0Σn=-∞∞{erfh+2nw-x2Dt+erfh-2nw+x2Dt}---(4)]]>在该等式中C(t，z)是在t时刻和x点的浓度，w是通道宽度，CO初始浓度。h是染料的初始宽度，可以根据上面解方程组得到的染料和缓冲液的比例关系得到(图12(a))。整个微流装置中最后的浓度分布可以用该方法得到(图12(b)是在通道b中的浓度分布，浓度C用初始CO标准化)。
图13是AO在本发明装置中的浓度梯度。白线代表微流通道的边界，它们在荧光图片中是不可见的。当染料溶液进入芯片装置两分钟以后，形成稳定的流动，此时拍摄得到荧光图片。可见，由于在A、C两点染料溶液和缓冲液混合扩散，沿通道abc形成浓度梯度。
图14是沿检测线(图13中的白色虚线，距离中间的水坝结构10微米)的荧光强度分布图。实线是模拟计算值，点线是实验数据。从图中可以看出，最高的浓度是分布在通道a中，然后浓度沿通道b和c逐渐下降形成不连续的浓度梯度。在通道c中，浓度分布是连续的。可以假定溶液在每个通道的混合都与通道c中的一样，如果在通道中溶液刚好完全混合时开始下一次稀释，可以在一系列通道中形成完全连续分布的浓度梯度。从图中可知，测量得到的浓度分布与模拟值十分吻合，因而扩散是这些微通道中溶液混合的主要原因。如果改变样品池SDL的液面高度，可以调节浓度梯度的大小。如图14所示，在样品池CW/A中的液压大小固定在18帕斯卡，改变样品池SDL的液面高度，使压力由30帕斯卡(图14(a))升高到36帕斯卡(图14(b))，最后到40帕斯卡(图14(c))，在通道b和c的浓度会逐渐减小，因而使浓度梯度变大。
在简单模式的数学模拟中，所有通道的流量都可以计算，下面是通道a和h的流量Qa＝0.080234hCW/A-0.021338hSDLQh＝-0.024635hCW/A+0.021338hSDLQ代表每个通道中的流量(Q＞0，流体流向混合点A，Q＝0，无流动，Q＜0，流体从A流向样品池)，h是样品池的液面高度。所有的模拟结果都用MATHEMATICA软件计算。根据这两个等式，与浓度梯度直接相关的流量分布受两个样品池中的液压分布的控制，结果参见表3。
表3梯度动力调节QaQha、b、c通道的浓度比例hSDL/hCW/A＞3.76 ＜0 ＞0 无3.76＞hSDL/hCW/A＞1.15＞0 ＞0 1∶Qa/Qb∶Qa/QchSDL/hCW/A＜1.15 ＞0 ＜0 1∶1∶Qb/Qc当液压比hSDL/hCW/A大于3.76时，Qa小于0，没有染料可以流入微流通道中，不能形成浓度梯度。当液压比hSDL/hCW/A小于1.15时，Qa大于0，Qh小于0，有些染料溶液流入通道h里面，而没有缓冲液在交点A稀释染料，因而在a和b通道中没有浓度差异。当液压比hSDL/hCW/A大于1.15，小于3.76的时候，Qa和Qh都大于0，可以在通道a、b、c中形成浓度梯度，在这种情况下，通道a、b、c中的浓度比为1∶Qa/Qb∶Qa/Qc。
利用该方法，通过改变样品池SDL中的液体压力，可以调节本发明装置中的浓度梯度。样品池SDL可以用作浓度梯度的调节器。如果增加样品池SDL中的液体压力，通道b和c中的浓度会逐渐减少，当样品池SDL中的液体压力超过一个临界点以后，不再有染料流入微流通道，所有的浓度都是零。这种情况可以用来清洗整个微流芯片。
因为扩散是本发明装置中层流流体混合的主要方式，因而扩散系数的大小会影响通道中的浓度梯度，以通道c为例。两种具有不同扩散系数的染料AO和TB(室温中两种物质在水中的扩散系数分别为4.4×10-6cm2/s和3.0×10-6cm2/s)将用于验证实验。在同样的控制模式下，两种染料具有不同的浓度梯度(图15)。因为AO具有更大的扩散系数，所以AO的浓度梯度下降比TB快(图中“◆”代表AO，“-”代表TB)。为了让两种染料具有相同的浓度梯度，必须调节TB扩散时的压力，使溶液的流动速度减慢，扩散时间延长。
在这些结果中，浓度梯度的测量值(图15中点代表测量值，线代表模拟值)比计算值下降更快。可能的原因是混合时两种溶液不是完全并排流动，缓冲液垂直流入染料溶液中可能导致扩散加强。引入一个矫正系数σ，Dr＝σD。如果σ＝1.4，矫正后的计算曲线和实验结果非常吻合(实线是AO的矫正曲线，虚线是TB的矫正曲线)。
如果想在简单的控制模式中产生更大的梯度，只可能让极少量的染料溶液从通道a流入通道b中，即Qa必须比Qb小很多。在这种情况下，轻微的波动可能导致浓度梯度的明显变化，从而引起实验结果的极大误差。甚至可能导致染料溶液不能进入微流通道。因而为了产生更高的浓度梯度，我们选择采用复杂的控制模式，在对称的装置上施加不对称分布的液体压力。由于SDL样品池中压力较大，CDW样品池中的压力较小，染料溶液不能进入通道b，而是越过A处的水坝结构进入通道d。部分缓冲液流入通道b，另一部分缓冲液流入通道d。缓冲液和染料溶液在A点混合扩散，部分染料分子扩散到b通道的缓冲液中。因而在通道b中染料浓度大大低于简单模式下的染料浓度，在a和b两个通道间产生极大的浓度梯度。在数学模拟中，为了分析的方便，我们假想在流往b和d两个通道的缓冲液之间存在一个界面(图16(a)中的白线)，在两部分缓冲液中存在两次扩散过程。首先，染料分子扩散进入流入通道d的缓冲液中，然后其中的一部分继续扩散到流入通道b的缓冲液中。在假想的界面上两部分缓冲液具有相同的浓度。通过式(12)计算流入通道d的缓冲液中染料分子的浓度，然后积分确定流入通道b的染料分子的总量。图16(a)是稀释交点A的混合和扩散模型，图16(b)是描述假想边界，图16(c)是浓度梯度结果(沿图13的检测线)。在图16(c)中，实验结果(点)比模拟结果稍小(线)，可能是因为染料分子是连续地扩散进入b通道，而不是假想中的独立的两部分，在假想边界上实际浓度应该低于计算值。
在本发明中，提供了一种把固定细胞和产生浓度梯度结合在一起的装置，并且细胞沿浓度梯度产生的方向成直线排列。因而可以通过一次扫描所有细胞检测反应物在某一浓度范围内对细胞的影响。
本发明的细胞固定机制可以高效率地运送并且温和地固定易碎的哺乳动物细胞。这些特点与传统的垂直于主流方向的水坝结构完全不同。在微系统中快速地运送细胞需要更高的液体压力(由液压，气压或者电动力等等产生)，但是在传统的设计中过高的压力会对脆弱的哺乳动物细胞造成很大的破坏，通常高压会把细胞挤碎在传统的水坝结构上。另一方面，如果减少压力，是细胞可以固定在传统的水坝结构上，细胞的运送速度将变得极慢，影响实验的进程。而且，太低的压力可能会导致严重的细胞吸附。由于很难既保证细胞运送的效率，又保证细胞温和固定，因而用传统的水坝结构很难成功操作哺乳动物细胞。
而本发明的水坝结构与主流方向平行，因而对细胞的运送几乎没有影响。同时，通过平衡流体可以减小跨水坝的压力差，便于固定脆弱的材料。换句话说，细胞在主流方向的流动速度大大大于垂直水坝结构的流动速度，因而可以在本发明的实物中同时实现高效的细胞运送和温和的细胞固定，而这在以前是互相矛盾的目标。
一旦细胞被固定在水坝结构的特定位置，液流将在此处受到比未固定细胞的位置更大的流动阻力。流动更趋向于流向未固定细胞的位置直到整个水坝结构被细胞完全占据。该液流动态变化的过程使HL60细胞沿水坝结构自组装成单一的直线(图4)。单列细胞的自组装是本发明的又一特点，它提供了比传统水坝结构更稳定、可重复的细胞生物实验环境。
首先，由于多余的细胞会被主流动带走，水坝结构可能固定的细胞数目由水坝的长度决定。这与传统的水坝结构完全不同，多余的细胞会堆积在前一层细胞上面，形成多层无法定量的细胞。其次，有与形成单层数目稳定的细胞，沿主流方向的流动阻力基本保持不变。而在传统的垂直水坝中，流动受固定细胞数目的影响，当细胞完全占据整个水坝结构后流动阻力会严重上升。沿主流方向稳定的流动阻力可以保证流量的正确计算，而这有是正确计算微通道中浓度梯度的关键。
本发明的优点还包括其潜在的可以简单地创造大范围动态稀释的能力，这可以极大地方便系列的稀释实验。本发明还可以使微流分析前样品稀释过程中的人为干扰降到最少。与早期的单交点稀释方法相比，早期稀释方法的稀释范围通常是由装置的几何结构决定的，在通道长度固定的情况下调节液体的压力或者控制电压对最后的稀释比例影响很小，因而早期的单交点装置难以创造较大的动态稀释范围。
权利要求
1.在芯片上进行细胞反应实验的装置，该装置包括用于液体流动的芯片表面复杂的三维微通道体系和向所述通道的第一部分提供载有细胞的液流的装置，其特征在于，所述通道的第二部分与所述通道第一部分有一部分相邻且平行延伸，二者在部分相邻的位置被沿通道壁方向的水坝结构分开，其中细胞和大颗粒不能通过水坝结构，液流可以通过水坝结构上方在两部分微通道之间自由流动。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于所述的两部分通道在多个区域并列延伸，在每个区域的两部分通道被沿管壁方向的水坝结构分开。
3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于所述的装置用于在所述的两部分通道的第一部分在第一种液压的驱动下流动载有细胞的液流，其中所述的装置在比第一种液压小的第二种压力的驱动下，第二部分通道中流动液流。
4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于它还包括供应反应物到所述的第一部分通道的装置，在所述通道中产生所述反应物浓度梯度，以及浓度梯度随通道中液流方向变化的装置。
5.根据权利要求4所述的装置，其特征在于所述的浓度梯度产生装置包括稀释所述的反应物的装置。
6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于其中产生稀释的装置包括至少一个稀释交点，在此交点稀释溶液通过至少一个其它通道进入所述的第一部分通道。
7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于通过在反应物流到所述的第一部分通道时，或者让缓冲液流到所述的第二部分通道，或者不流到所述的第二部分通道，提供在第一和第二种稀释模式间转换的装置。
8.根据权利要求7所述的装置，其特征在于在第一个位置提供第一个稀释交点，在第二个位置提供第二个稀释交点，所述的第一个位置在反应物所在的第一部分通道的上游位置，第二个位置在下游位置。
9.在芯片上监测细胞反应的装置，其特征在于它还包括沿第一方向延伸的直线上固定多个活细胞的装置，给这些细胞提供反应物的装置，在所述的直线上形成上述反应物的浓度梯度的装置。
10.在监测细胞反应的芯片上产生所提供反应物浓度梯度的装置，其特征在于它还包括用于接受所述的反应物的第一部分通道，邻近所述的第一部分通道且互相有液流交换的第二部分通道，给所述的第一部分通道提供稀释液流的至少另外一条通道，选择性地供应或者不供应缓冲液到所述的第二部分通道的装置，以及通过供应或者不供应缓冲液到所述的第二部分通道选择所述的装置工作在两种不同的稀释模式中的一种。
11.根据权利要求10中所述的装置，其特征在于所述的至少另外一条通道在第一个稀释交点给所述的第一部分通道提供稀释缓冲液，其中所述的装置进一步包括在第二个稀释交点给所述的第一部分通道提供稀释缓冲液的另一条通道，所述的第一个交点比第二个交点在第一部分通道反应物流动方向上更靠近上游位置。
12.一种在芯片上监测细胞反应实验的方法，其特征在于所述的方法包括沿第一方向延伸的直线上固定多个活细胞、给所述的细胞提供反应物，在所述的直线上形成上述反应物的浓度梯度。
13.一种在芯片上监测细胞反应的装置中固定细胞的方法，其特征在于所述的方法包括给所述的装置提供其中至少有一部分相互并列并且在其长度所述的至少一部分被沿管壁方向的水坝结构分开，溶液可以通过水坝结构进入相邻的通道的第一和第二两部分液流通道，在第一种液压的驱动下让载有细胞的流体进入第一部分通道，在小于第一种压力的第二种液压的驱动下使液体进入所述的第二部分通道。
14.一种在芯片上监测细胞反应的装置中产生反应物浓度梯度的方法，其特征在于所述的方法包括提供所述的反应物到第一部分通道，选择性地给所述的第一部分通道邻近且互相有流动交换的第二部分通道提供缓冲液，以及在稀释交点给所述的第一部分通道提供稀释试剂。
全文摘要
本发明涉及用于监测芯片上的细胞反应的装置和方法，特别是利用与水流方向平行的水坝结构软固定细胞的装置和方法。本发明还涉及能产生控制的浓度梯度，特别是与固定后的细胞排列方向一致的浓度梯度的方法。
文档编号B01L3/00GK1451742SQ03120720
公开日2003年10月29日 申请日期2003年3月18日 优先权日2002年3月18日
发明者杨梦苏, 李卓荣 申请人:香港城市大学