专利名称：葡聚糖凝胶介质及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种葡聚糖凝胶介质，尤其涉及一种大孔葡聚糖凝胶介质及其制备方法。
背景技术：
在生物下游处理过程中，层析分离技术具有其它分离手段无法替代的地位。层析技术的发展是以分离介质的开发和过程理论的完善为前提的，其中新型层析技术的开发一直是层析领域研究的热点之一。理想的层析介质不仅具有较高的吸附容量，而且应当满足快速、高分辨率和低非特异性吸附的要求。由此开发出了大孔介质，这些大孔介质在原有介质制备过程中生成纳米级扩散孔的基础上，加入某种致孔剂而形成一定量较大的流通孔。所说的致孔剂可以是液体的，如己烷等有机溶剂；也可以是固体的，如碳酸钙，如中国专利03130027.8公开了一种高容量大孔琼脂糖凝胶介质的制备方法，该方法在制备过程加入了固体致孔剂碳酸钙，达到提高传质速率及动态吸附容量的效果。但由于(未交联的)琼脂糖凝胶介质在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，一般使用化学灭菌或处理，但是化学灭菌或处理使用的是叠氮化钠等易燃易爆危险品。
另一方面，葡聚糖凝胶介质，由于其良好的膨胀程度、亲水性、亲脂性、可用于分离不溶于水的物质，层析时流速快，单位体积交换量大，且成本低廉，在生物分离技术中广泛地使用。但由于葡聚糖与琼脂糖等上述大孔介质在性质、制备和使用等方面差异较大，目前未见有大孔葡聚糖凝胶介质或其报道，现有的葡聚糖凝胶介质的制备方法通常采用油水两相法，为在室温下，配制浓度为1-50％葡聚糖水溶液，此水溶液含有1-20％的氢氧化钠，然后将溶液加入体积量为水相体积3-10倍的含乳化剂(如Span 60)的有机溶剂(如透平油)中，搅拌进行乳化反应后，再加入体积比为10-50％的环氧氯丙烷搅拌，然后升温交联固化形成微球(US专利4,794,177)。这样制成的葡聚糖凝胶介质的凝胶孔(作用类似于扩散孔)的孔径均在纳米数量级(约100nm左右)，生物大分子由于分子量较大，不易进入凝胶孔中，使得生物大分子很难被凝胶介质吸附住，从而降低凝胶介质的吸附容量；即使进入了凝胶孔的生物大分子，也不易从凝胶孔中扩散出来，造成凝胶孔堵塞，分离缓慢，延长分离时间。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术中的问题，提供一种新的大孔介质，具体而言是一种大孔葡聚糖凝胶介质。
本发明的葡聚糖凝胶介质除了含有纳米级的凝胶孔(其孔径范围一般小于100纳米)外，还含有流通孔，也可以称贯通孔，这些流通孔的孔径大于凝胶孔孔径。本发明的葡聚糖凝胶介质中孔径较大的流通孔将彼此分离的孔径较小的若干凝胶孔贯通起来。生物分子在分离纯化的过程中，先进入流通孔中，然后再进入凝胶孔(分子量较小的生物分子)，或者不进入凝胶孔(分子量较大的生物分子)，从而将分子量大小不同的生物分子分离开来；同时又由于有了大孔径的流通孔，生物分子在分离过程中不易受阻，从而达到提高传质速率及动态吸附容量的目的。
所述的流通孔的孔径较佳地是不超过1.5微米，更佳地是至少为0.75微米，即0.75-1.5微米。此范围的大孔葡聚糖凝胶介质在综合传质速率、吸附容量、凝胶载量及成本等各方面，具有较佳的效果。
本发明中所说的葡聚糖凝胶介质是指由天然或人工合成的各种葡聚糖或其衍生物为原料制成的一大类型凝胶介质，其中，上述葡聚糖是指由葡萄糖分子经α-糖苷键或β-糖苷键联结而成的各种分子量多糖，而其衍生物是指在葡聚糖中葡萄糖分子的基本结构上，被取代一个或多个原子、分子官能团或基团。由此制成的凝胶介质包括常规的均质型凝胶，以及葡聚糖结构中修饰有各种离子交换配基的离子交换凝胶，如阳离子葡聚糖交换凝胶介质和阴离子交换葡聚糖凝胶介质。
本发明的另一目的是提供上述的葡聚糖凝胶介质的制备方法，其在上述常规油水两相法的基础上，通过在原有葡聚糖碱性水溶液中，加入致孔剂无机固体微粒，并分散制成悬浮液作为原料，且最后将制得的葡聚糖凝胶介质中包裹的该无机固体微粒溶解去除而制得本发明的大孔葡聚糖凝胶介质。
具体而言，本发明制备方法的具体步骤为①将无机固体微粒分散于含有葡聚糖的碱性溶液中，制成悬浮液；②将该悬浮液与含有乳化剂的有机溶剂混合，并搅拌，制成乳化液；③将环氧氯丙烷加至步骤②制得的乳化液中进行交联固化，制得包裹有无机固体微粒的葡聚糖凝胶介质微球；④溶解去除该无机固体微粒。
同现有技术中使用致孔剂的方法原理一样，本发明选用不参与原有葡聚糖凝胶介质制备反应，且最后能单独除去的物质作为致孔剂。不溶或难溶于水(在20℃的温度条件下，在水中的溶解度不足1个重量百分点(1g/l))，但最终可被单独溶解去除的无机化学沉淀物质均可被选为本发明的致孔剂。换言之，其可以是能分散于葡聚糖碱性水溶液形成悬浮液以作为原料液，并最终能被单独溶解去除的任何无机固体微粒。其较佳地为无机盐，如碳酸盐碳酸钙或碳酸钡，或磷酸盐等；和/或金属氧化物，如氧化铁、氧化铝或氧化铜等。所述的无机固体微粒更佳地为金属氧化物。选择碳酸盐及金属氧化物作为固体致孔剂，可以容易地溶解于稀酸中而被去除，而且碳酸钙、碳酸钡、氧化铁、氧化铝、氧化铜都是价廉易得的化工产品；而采用金属氧化物作为致孔剂，不但可以容易地溶解在稀酸中，而且不会产生气泡，从而可提高设备的利用率、减少对凝胶的影响。
为得到上述较佳流通孔孔径的葡聚糖凝胶介质，相应地所选的无机固体微粒的粒径需大于现有凝胶孔的孔径，即超过100nm，较佳地为不超过1.5微米，更佳地为0.75-1.5微米。由于固体致孔剂的粒径会影响致孔的效果和在葡聚糖碱性溶液中的分散效果若固体致孔剂微粒的粒径较大，则制得凝胶介质的空体积相对较多，凝胶介质的载量相对也会下降；而且还会使得其在葡聚糖碱性溶液中的沉降速度加快，不利于其均匀分散；若固体致孔剂微粒的粒径较小，则制得的凝胶介质的孔径相对较小，而且小粒径的固体致孔剂微粒价格较贵。
所述的致孔剂无机固体微粒在每100mL悬浮液中的质量较佳地为5-25g。若致孔剂的加入量太多，则分散效果不是很好而且凝胶介质的空体积相对较多，相对降低凝胶的载量；若致孔剂的加入量太少，则致孔效果不是很好，有效孔相对较少。
本发明制备方法中的葡聚糖在该碱性溶液中的浓度较佳地为200-300g/L。葡聚糖在溶液中的浓度直接影响溶液的粘度，粘度太大则微粒不易分散均匀；粘度太小，则固体致孔剂微粒容易沉降，也不易分散均匀。
本发明制备方法最后为溶解去除包裹在葡聚糖凝胶介质中的无机固体微粒以致孔，采用能单独溶解该无机固体微粒，但不与凝胶介质发生发应的物质清洗该葡聚糖凝胶介质，以去除该无机固体颗粒。本发明选用能溶解上述无机盐及金属氧化物的无机酸，如盐酸或硫酸等，用0.1～1.0M的稀酸即可。当然，用酸清洗后，还可以将清洗后的微球在稀酸中浸泡数小时，以尽可能除净残余的无机固体微粒。
至于本发明制备方法步骤1中的葡聚糖碱性溶液配制、步骤2的乳化和步骤3的交联步骤可为常规现有技术，如上述美国专利所述。为取得较好的乳化效果，乳化时可予以较高速(一般≥700rpm/min)搅拌。
如为制备大孔离子交换型葡聚糖凝胶介质，也可以进一步使上述均质型大孔葡聚糖凝胶进行常规羧甲基化等反应接上阳离子、阴离子基团即可。
本发明的有益效果在于本发明的葡聚糖凝胶介质在保持原有葡聚糖凝胶介质优点的同时，具有动态吸附容量、静态吸附容量和传质速率高等特点，介质内大孔的存在有助于实现快速分离；其生物相容性好、亲水性好，在酶的固定化、细胞分离、质粒DNA和蛋白质等生物大分子的分离纯化等方面具有广泛的应用前景。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明技术方案予以进一步的说明。但本发明并不仅限于此。
实施例1在25℃下，通过快速搅拌将12克粒径平均1μm、分布0.75-1.5μm范围的碳酸钙微粒均匀地分散在100mL 300g/L葡聚糖溶液中，该溶液同时溶解了20g氢氧化钠。然后将该悬浮液快速倒入含15g/L Span 60的850mL透平油中，控制搅拌速度700rpm，反应30min。升温至28℃-38℃，再加入体积80mL的环氧氯丙烷搅拌，然后升温至60℃，继续固化反应6小时，固化形成微球，获得包裹碳酸钙微粒的葡聚糖凝胶介质。收集到的微球先用乙醇和蒸馏水反复洗涤除去残余有机相。向清洗后的微球中加入1500mL水，再加1500mL 0.2mol/L稀盐酸，并放入摇床中反应一段时间后(一般为16小时以上)，再重复上述去除碳酸钙的步骤。最后用1500mL 0.1mol/L稀盐酸浸泡12小时，进一步除去残余的碳酸钙微粒。扫描电镜下观察其孔径为0.75～1.5μm左右，与微粒粒径相仿。
实施例2在25℃下，通过快速搅拌将5克粒径1μm、分布0.75-1.5μm碳酸钙微粒均匀地分散在100mL 200g/L葡聚糖溶液中，该溶液同时溶解了8g氢氧化钠。然后将该悬浮液快速倒入含12.5g/L Span60的650mL透平油中，控制搅拌速度800rpm，反应30min。升温至28℃-38℃，再加入体积50mL的环氧氯丙烷搅拌，然后升温至60℃，继续固化反应6小时，固化形成微球，获得包裹碳酸钙微粒的葡聚糖凝胶介质。收集到的微球先后用乙醇和蒸馏水反复洗涤除去残余有机相。向清洗后的微球中加入1000mL的水，再加1000mL0.2mol/L稀盐酸，并放入摇床中反应一段时间后，再重复上述去除碳酸钙的步骤。最后用1000mL 0.1mol/L稀盐酸浸泡12小时，进一步除去残余的碳酸钙微粒。电镜下观察其孔径为0.75～1.5μm左右。
实施例3在25℃下，通过快速搅拌将15克粒径0.75μm氧化铁微粒均匀地分散在100mL 250g/L葡聚糖溶液中，该溶液同时溶解了12g氢氧化钠。然后将该悬浮液快速倒入含10g/L Span60的750mL透平油中，控制搅拌速度900rpm，反应30min。升温至28℃-38℃，再加入体积60mL的环氧氯丙烷搅拌，然后升温至60℃，继续固化反应6小时，固化形成微球，获得包裹氧化铁微粒的葡聚糖凝胶介质。收集到的微球先用乙醇和蒸馏水反复洗涤除去残余有机相。向清洗后的微球中加入1500mL水，再加1500mL 0.2mol/L稀盐酸，并放入摇床中反应一段时间后，再重复上述去除氧化铁微粒的步骤。最后用1500mL 0.1mol/L稀盐酸浸泡12小时，进一步除去残余的碳酸钙微粒。电镜下观察其孔径为0.75μm左右。
实施例4在25℃下，通过快速搅拌将25克粒径1.5μm碳酸钡微粒均匀地分散在100mL 250g/L葡聚糖溶液中，该溶液同时溶解了8g氢氧化钠。然后将该悬浮液快速倒入含12.5g/L Span60的650mL透平油中，控制搅拌速度800rpm；反应30min。升温至28℃-38℃，再加入体积50mL的环氧氯丙烷搅拌，然后升温至60℃，继续固化反应6小时，固化形成微球，获得包裹碳酸钡微粒的葡聚糖凝胶介质。余同实施例1去除碳酸钡微粒，电镜下观察其孔径为1.5μm左右。
实施例5～7分别取实施例1、2和3制备得到的葡聚糖凝胶介质，进行羧甲基化反应，具体方法是取20克葡聚糖凝胶介质于500mL的烧瓶中，加入200mL2.0mol/L NaOH溶液，在50℃反应1小时，然后加入50mL 5mol/L氯乙酸溶液反应2小时，取出反应后的凝胶介质在砂芯漏斗中用去离子水洗至中性，分别得到3种大孔阳离子葡聚糖凝胶介质。
上述实施例中的碳酸钙微粒，碳酸钡，氧化铁，葡聚糖等所用原料均为常规市售产品。其中，氧化铁微粒可换成氧化铝或氧化铜微粒等，均可得到本发明的大孔葡聚糖凝胶介质，在此不一一赘述。
应用实施例1在标准层析柱(Z10/30上海锦华层析设备厂)中分别装填2mL实施例1、2和3制备得到的葡聚糖凝胶介质及均质型凝胶[Sephadex G-25，GEHealthcare(通用医疗集团)]，考察最快流速的变化规律。本发明的葡聚糖凝胶由于存在许多的大孔，能在凝胶介质内产生对流，相对减少了压降，可以在更高的流速下进行操作，结果如下表。
应用实施例2将上述均质型凝胶按实施例5～7的方法进行羧甲基化反应得到阳离子葡聚糖凝胶介质(均质型组)。考察其与实施例5～7的各种阳离子葡聚糖凝胶介质的吸附容量，现有商品化阳离子葡聚糖凝胶介质CM Sephadex C-50(GE Healthcare)作为对照在0.02mol/L乙酸缓冲液(pH4.8)中考察其核糖核酸酶的静态吸附量；在标准层析柱(Z10/30上海锦华层析设备厂)中装填2mL阳离子葡聚糖凝胶介质，流速均为95cm/h，蛋白为1mg/ml的核糖核酸酶，考察其动态吸附量(在10％穿透点下计算动态吸附量)，结果如下表所示。
权利要求
1.一种葡聚糖凝胶介质，其具有凝胶孔，其特征是该葡聚糖凝胶介质具有流通孔，该流通孔孔径大于凝胶孔孔径。
2.如权利要求1所述的葡聚糖凝胶介质，其特征是该流通孔的孔径不超过1.5微米。
3.如权利要求2所述的葡聚糖凝胶介质，其特征是该流通孔的孔径至少为0.75微米。
4.一种权利要求1～3所述的葡聚糖凝胶介质的制备方法，其将致孔剂无机固体微粒分散于葡聚糖碱性水溶液中，制成悬浮液作为原料，并将通过常规方法制得的葡聚糖凝胶介质中包裹的该无机固体微粒溶解去除。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是所述的无机固体微粒为碳酸盐和/或金属氧化物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是所述的碳酸盐为碳酸钙或碳酸钡；所述的金属氧化物为氧化铁、氧化铝或氧化铜。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是所述的无机固体微粒的粒径为0.75-1.5微米，其在每100mL悬浮液中的质量为5-25g。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是所述的葡聚糖在该碱性溶液中的浓度为200-300g/L。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是最后采用能溶解该无机固体微粒的无机酸清洗该葡聚糖凝胶介质，以去除该无机固体颗粒。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是该无机酸为盐酸或硫酸。
全文摘要
本发明公开了一种葡聚糖凝胶介质及该葡聚糖凝胶介质的制备方法，该葡聚糖凝胶介质具有流通孔，该流通孔孔径大于凝胶介质本身的凝胶孔孔径。其制备方法是以无机固体微粒为致孔剂，并结合了常规的油水两相法。本发明的葡聚糖凝胶介质是一种大孔介质，介质内大孔的存在有助于实现快速分离，故其在保持原有葡聚糖凝胶介质优点的同时，兼有传质速率高的特点；且其生物相容性好、亲水性好，在酶的固定化、细胞分离、质粒DNA和蛋白质等生物大分子的分离纯化等方面具有广泛的应用前景。
文档编号B01J20/291GK1868577SQ20051002615
公开日2006年11月29日 申请日期2005年5月25日 优先权日2005年5月25日
发明者徐伟, 王芝祥 申请人:上海医药工业研究院