专利名称：电层析分离制备生物物质的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种用于生物科学领域的分离方法，具体是一种电层析分离制备生物物质的方法。
背景技术：
毛细管电层析是综合了高效液相层析和毛细管电泳的优势而发展起来的一种微分析技术，具有高效、快速、样品用量少的特点。毛细管电层析的局限性是只能用于微量分析，不能用于样品的制备。
目前，国外有些学者正在进行制备型电层析的研究。经对现有技术的文献检索发现，比较典型的制备型电层析方法见Carlos M.Tellez和Kenneth D.Cole发表在Electrophoresis(电泳)2000年第21卷第1001-1009页的文章Preparativeelectrochromatography of proteins in various types of porous media(蛋白质在各种类型的多孔介质中的制备型电层析)。此文献的目的是用制备型电层析技术分离蛋白质类生物大分子，所用的固定相是体积排阻葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶，洗脱液是3.9mmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷)和47mmol/L甘氨酸组成的缓冲液(pH8.3)，分离α-乳请蛋白、β-乳球蛋白、γ-球蛋白、牛血清白蛋白。这种方法的不足和缺陷是只能用于分离蛋白质等生物大分子，不能用于分离小分子物质。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足和缺陷，提出一种电层析分离制备生物物质的方法。通过改变固定相和缓冲液，可分离如抗生素、有机酸、生物碱等小分子物质，也可分离如蛋白质、核酸等大分子物质，适用范围广。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明用制备规模的电层析方法分离生物物质，具体步骤如下(1)装柱，将处理好的固定相加入电层析柱中；(2)平衡电层析柱，向电层析柱中注入缓冲液，直到进入柱内和流出柱外的缓冲液的pH及组成相同；
(3)加样，将需要分离的样品加入电层析柱中；(4)电层析，向电层析柱中加入缓冲液，开启与柱两端的电极相连接的高压电源，收集流出液，进行分析或进一步纯化。
所述的电层析柱内可装填各种固定相。固定相的颗粒大小为10-1000μm。固定相体积为1-4000ml。所述的固定相为离子交换树脂、吸附树脂、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶的任一种。所用的缓冲液为无机盐或有机盐及酸、碱配制成。包括磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、乙酸盐、Tris(三羟甲基氨基甲烷)、氨基酸。
缓冲液中加入乙醇、甲醇、丙酮水溶性有机溶剂；缓冲液中盐类浓度范围为0.01-0.50mol/L，pH范围为2-10，有机溶剂含量为0％-60％。
所述的需要分离的样品是水溶性的离子性生物产物，如抗生素、生物碱、有机酸、蛋白质、核酸等。
在电层析柱的进口处加入需要分离的样品，加样量为0.1-2000mg。
本发明具有层析法选择性好、电泳法分辨率高的优点；成本低；样品处理量大，可达毫克级至克级，可做制备用；可由操作者手工装柱；通过改变固定相和缓冲液，可用于分离大分子物质(如蛋白质、核酸)，也可用于分离小分子物质(如抗生素、有机酸、生物碱)；通用性强，适用范围广。本发明供化学、化工、生物、制药、食品、环境保护等领域使用，用于实验室中生物物质的分离纯化和样品制备。
具体实施例方式
实施例1四环素和博来霉素分别用0.06mol/L丙氨酸-乙酸缓冲液(pH3.0)配制为10mg/ml溶液，各取25μl样品，混合后进样。固定相为MCI-Gel大孔吸附树脂，用0.06mol/L丙氨酸-乙酸缓冲液(pH3.0)∶乙醇(V∶V)＝3∶1洗脱。在通电情况下，四环素先流出，博来霉素后流出，两种物质得到分离。如果不通电，在相同条件下按通常层析法操作，则四环素和博来霉素不能分离。
实施例2头孢唑林钠、头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢他啶、头孢拉定5种抗生素，分别配制成50mg/ml水溶液。5种抗生素的水溶液各取100μl，混合后进样。固定相用强酸性1×2型阳离子交换树脂，0.1mol/L丙氨酸-乙酸缓冲液∶乙醇(V∶V)＝40∶60洗脱，pH从3.0梯度升高到8.8。在电层析时，抗生素依次从柱中流出，得到分离。
实施例3从茶多酚粗提物中纯化分离酯型儿茶素(L-表没食子儿茶素没食子酸酯，L-EGCG)。将茶多酚粗提物配制成40mg/ml水溶液，取0.5ml进样。固定相为MCI-Gel大孔吸附树脂，0.02mol/L丙氨酸-乙酸缓冲液(pH 6.5)∶乙醇(V∶V)＝80∶20洗脱。电层析分离出两个峰，前面是酯型儿茶素，后面是杂质。如果不通电，在同样条件下层析，只有一个峰流出，酯型儿茶素和杂质不能分离。
实施例4样品为0.5ml牛血清白蛋白(50mg/ml)和0.5ml牛血红蛋白(20mg/ml)的混合物。固定相为DEAE-Sepahdex A-50葡聚糖凝胶，0.05mol/L Tris-HCl(pH8.3)平衡后，用0.05mol/L Tris-HCl(pH8.3，含0.1mol/L NaCl)洗脱。通电时两种蛋白分开成两个峰。如果不通电，在同样条件下层析，只有一个峰流出，两种蛋白没有分离开。
实施例5样品为20ml人血清。固定相为DEAE-Sepahdex A-50葡聚糖凝胶，0.05mol/LTris-HCl(pH8.3，含0.1mol/L NaCl)平衡后，用0.05mol/L Tris-HCl(pH8.3，含0.2mol/L NaCl)洗脱。电层析分离出10余个峰。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测每个峰中所含的蛋白种类，每个峰内含1～3种蛋白质。如果不通电，用同样的柱、同样的固定相和同样的进样量作层析分离，缓冲液为0.01mol/L Tris-HCl(pH8.3，NaCl浓度从0.2mol/L线性增加到0.7mol/L)，仅分离出5个峰，每个峰内含1～5种蛋白质。
权利要求
1.一种电层析分离制备生物物质的方法，其特征是，用制备规模的电层析方法分离生物物质，具体步骤如下(1)装柱，将处理好的固定相加入电层析柱中；(2)平衡电层析柱，向电层析柱中注入缓冲液，直到进入柱内和流出柱外的缓冲液的pH及组成相同；(3)加样，将需要分离的样品加入电层析柱中；(4)电层析，向电层析柱中加入缓冲液，开启与柱两端的电极相连接的高压电源，收集流出液，进行分析或进一步纯化。
2.根据权利要求1所述的电层析分离制备生物物质的方法，其特征是，所述的电层析柱内装填各种固定相。
3.根据权利要求1或者2所述的电层析分离制备生物物质的方法，其特征是，所述的固定相的颗粒大小为10-1000μm，固定相体积为1-4000ml。
4.根据权利要求1或者2所述的电层析分离制备生物物质的方法，其特征是，所述的固定相为离子交换树脂、吸附树脂、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶的任一种。
5.根据权利要求1所述的电层析分离制备生物物质的方法，其特征是，所述的缓冲液为无机盐或有机盐及酸、碱配制成。
6.根据权利要求1或者5所述的电层析分离制备生物物质的方法，其特征是，所述的缓冲液，包括磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、乙酸盐、三羟甲基氨基甲烷、氨基酸。
7.根据权利要求1或者5所述的电层析分离制备生物物质的方法，其特征是，所述的缓冲液，缓冲液中加入乙醇、甲醇、丙酮水溶性有机溶剂。
8.根据权利要求1或者5所述的电层析分离制备生物物质的方法，其特征是，所述的缓冲液，缓冲液中盐类浓度范围为0.01-0.50mol/L，pH范围为2-10，有机溶剂含量为0％-60％。
9.根据权利要求1所述的电层析分离制备生物物质的方法，其特征是，所述的需要分离的样品，是水溶性的离子性生物产物。
10.根据权利要求1或者9所述的电层析分离制备生物物质的方法，其特征是，所述的需要分离的样品，在电层析柱的进口处加入需要分离的样品，加样量为0.1-2000mg。
全文摘要
一种电层析分离制备生物物质的方法。用制备规模的电层析方法分离生物物质，具体步骤如下(1)装柱，将处理好的固定相加入电层析柱中；(2)平衡电层析柱，向电层析柱中注入缓冲液，直到进入柱内和流出柱外的缓冲液的pH及组成相同；(3)加样，将需要分离的样品加入电层析柱中；(4)电层析，向电层析柱中加入缓冲液，开启与柱两端的电极相连接的高压电源，收集流出液，进行分析或进一步纯化。本发明具有层析法选择性好、电泳法分辨率高的优点；成本低；样品处理量大，可做制备用；可由操作者手工装柱；通用性强，适用范围广。
文档编号B01D15/08GK1706536SQ20051002507
公开日2005年12月14日 申请日期2005年4月14日 优先权日2005年4月14日
发明者赵凤生, 钱秀萍, 冯蕾 申请人:上海交通大学