多级分纯化方法和用于所述方法的设备的制作方法

专利名称：多级分纯化方法和用于所述方法的设备的制作方法
技术领域：
本发明涉及多层柱(multicolumn)纯化方法及其优化的领域。在先技术分批色谱法众所周知并常规地和预备地应用于工业生产。然而，由于溶剂消耗高并且柱材料昂贵，该技术相当的昂贵，尤其对于大规模分离和纯化而言，需要对色谱装置的使用进行优化才能实现盈利。在实际生产中，对于大规模分离而言，连续过程要比分批过程经济得多。连续方法的优点是，例如，同时实现高产率和高纯度、溶剂消耗较少、分馏和分析的成本较低、待纯化量的灵活性更好等。实现连续色谱过程的一种方式是所谓的模拟移动床法(Simulated Moving Bed Process, SMB,综述参见例如 Markus Juza, Marco Mazzotti 禾口 Massimo Morbidelli, Simulated moving-bed chromatography and its application to chirotechnology, Trends in biotechnology, Elsevier B. V.，TIBTECH，2000 年 3 月，18 卷，108-118 页)。这一方法能够通过调整两个入口流(进样，洗脱液)和两个出口流(萃余液，萃取液)而将混合物分成两个级分。SMB法是逆流式的，因此以高产率良好地分离两种组分是可能的。SMB 技术在工业中的典型实例是手性分离，其中从外消旋混合物中分离两种对映体。如果选择性很低，则分批方法导致在回收(产率)和生产率方面的低性能，而SMB却可以具有高性能。对SMB法已提出过多种修改，以进行优化并使其适合特定的分离问题。例如，提出改变入口流和出口流的各自连接和断开的时刻，即入口流和出口流不像在经典的SMB 中那样同步切换，而是依照特定的和分阶段的方案切换(所谓的Varicol技术，参见例如 W0-A-2004/039468)。另一种修改由Morbidelli 等提出(参见例如〃 PowerFeed operation of simulated moving bed units :changing flow-rates during the switching interval " Ziyang Zhang, Marco Mazzotti, Massimo Morbidelli, Journal of Chromatography A, 1006(2003)87-99, Elsevier B. V)，其中为了补偿每个循环时间后因离散的切换而引起的萃取液和萃余液输出浓度随时间的变化，洗脱液的流速以补偿性的方式变化，与切换间隔相协调，使得纯度甚至更高(所谓的自动推进(Powerfeed)技术)。已提出第三种准模拟的变化，其中洗脱液的流速不变化，但进样的浓度以补偿性的方式变化，以实现相同的目标(所谓的Modicon技术，参见例如WO 2004/014511)。如已经提到的，尤其大规模色谱是费力和昂贵的技术。它对于大规模分离有价值的分子最有用。市场上最有价值的药用分子是生物分子，例如肽、蛋白质和抗体。这些分子通常采用溶剂梯度分批色谱进行纯化。术语“分离”在本申请的上下文中应当代表将组分的混合物分成两种级分，与之不同的是，在本申请中“纯化”代表将至少m种组分的混合物分离成至少m种级分(m大于等于3)，而所期望的产物居间吸附在一种或多种弱和强吸附的杂质之间，从而至少产生三个级分，仅有产品组分以纯品形式获得。
一个SMB循环仅能将进样流分成两个级分，但对于纯化来说，需要三种级分，期望的组分在居间级分中。可要求两个分步或顺次的SMB来纯化含有所期望的的居间生物分子以及强吸附和弱吸附杂质的多组分混合物，然而问题是，如果例如在第一阶段SMB中产生第一萃余液和第一萃取液，并在第二阶段SMB中将第一萃取液分离成第二萃余液(所需产品)和第二萃取液，则所有应该在第一阶段分离(并应该留在第一萃余液中)的不期望组分必然留在第二萃余液中，这尤其是在所需级分的浓度低时使得这种方法没有用处。除了上边的那些，还对SMB方案应用了其他改性剂变化，例如几年来SMB过程也以所谓的“溶剂梯度模式”进行(参见例如US 4，031，155)。这种“溶剂梯度”的意思是SMB 包括在不同改性剂水平上操作的区段。这种梯度类型是“分步梯度”。然而对于生物分子的纯化而言，需要平稳的线性梯度，如通常在(线性)溶剂梯度分批纯化中所应用的那样。WO 2006/116886中公开了一种改进，其利用SMB和分批技术的组合，并包括再循环(recycling)或“短回路(short-circuit) ”步骤。在这一文献中提出了通过单独的色谱柱对多组分混合物进行连续或准连续纯化的方法，其中使用至少一种溶剂将所述混合物送进所述色谱柱中。多组分混合物至少包含弱吸附杂质A、代纯化的居间产物B和强吸附杂质C，而柱分成至少4个区段(α，β, Y, δ )，其中第一个区段α具有至少一个溶剂入口和已纯化居间产物B的至少一个出口，以使纯化的居间产物B从系统中洗出，但强吸附杂质 C保持在α区段中；第二个区段β具有至少一个溶剂入口和至少一个与第四区段δ之入口相连接的出口，这样被强吸附杂质C所污染的居间产物B被从所述的出口洗入第四区段 δ (短回路)，但在β区段中保留了纯的强吸附杂质C;第3区段γ具有至少一个溶剂入口以及强吸附杂质C的出口，从而从所述出口洗出强吸附杂质C，并清洗色谱柱；第四个区段 δ具有至少一个入口来接收第2区段β出口的输出和至少一个入口来接收多组分混合物进样以及至少一个弱吸附杂质A出口，从而将弱吸附杂质从系统中洗出，但保留居间产物B 于δ区段中。在这一系统中，切换时间之后或之中，第一区段的最后一个柱被移动到第二区段的第一个位置，第二区段的最后一个柱被移动到第三区段的第一个位置，第三区段的最后一个柱被移动到第四区段的第一个位置，第四区段的最后一个柱被移动成为第一区段的第一个柱。US 5，093，004(等同于EP 0 415 821)专门涉及液相和固相的模拟逆流操作，其中明确地说明“换而言之，本发明的目的是将模拟逆流梯度和洗脱梯度技术联合到单一的连续操作过程之中，[...]。”。所述模拟逆流操作的核心特征是液体流动方向上的后续柱仅接受前边柱的输入并最终接受来自外部溶剂来源的输入。这一核心特征也在这一现有技术中有所强调，例如在图2中。区段外部的所有再循环流(例如图2中的连接7)仅包含纯溶剂，如说明书中详细说明的一样。EP 415 822与US 5，093，004基本相同，仅有5个区域，其中US 5，093，004中的区域1(吸附剂的重新恢复)被省掉。发明概述本发明的目的是提供进一步的改进，尤其是对WO 2006/116886所述方法的进一步改进。本发明特别地涉及改进两个主要的方面，即一方面，对分离真正的多产物混合物的方法进行重大修改，从而使得不仅可以个据WO 2006/116886分离成4个级分(因为WO 2006/116886事实上允许分离4个级分A、B、C和第四种带有示踪剂的级分)，而且还允许分离成至少5个级分，原则上可高至分离成任何更大整数个级分。因此，可以以纯品的形式获得超过四种组分(在一个级分中基本只有一种组分的情况下)。注意组分数等于或大于级分数。另一方面，对WO 2006/116886的方法提出了重大修改，使得可以在引入到纯化循环之前对柱进行有效的清洗，和/或使得可以使进样连续流入，即便该过程以非连续模式进行(即有两种或更多种交替的流程)时也是如此。所以，改进涉及并始于依据WO 2006/116886的设置，其中有如下多个用其功能定义的区段来分离三个级分A、B、C :区段α 将纯化的居间产物洗出系统，但将强吸附杂质C保留在该区段中。区段β :将被强吸附杂质所污染的居间产物B洗入区段δ，但将强吸附杂质保留在该区段中。区段Υ :洗出强吸附杂质并清洗该区段的色谱柱。区段δ 将弱吸附杂质洗出系统，但将期望的产物保留在该区段中。使进样进入纯化系统。在使用6个柱(也参见图幻的情况下，这意味着一个柱(区段Y)具有让所有强吸附杂质C离开柱的功能；一个柱(区段β )具有让所有的居间产物B离开柱而将强吸附杂质C保留在该柱中的功能；一个柱(区段α)具有确保仅有居间产物B (而没有强吸附杂质C)离开该柱的功能；一个柱(区段δ中的一个，5g)具有让所有弱吸附杂质A离开柱而将居间产物B保留该在柱中的功能；一个柱(区段δ中的另一个，Sf)具有使进样Fd进入柱和使第一种弱吸附杂质A离开柱的功能；一个柱(区段δ中的另一个，δ》具有确保没有居间产物B离开柱和从柱中除去示踪剂的功能。这样的设置也可被分成3个相互联系的柱和3个不相联系的柱，与这6个柱的设置完全一样。3个相互联系的柱的道被称为“CCL” (Counter Current-Lane，逆流道)，而不相联系的柱的道被称为“BL”(Batch-Lane，分批道)。CCL由位置2、4、6的柱(β、Sg、δ》 组成，而BL由位置1、3、5的柱(γ、α、δ》组成。当6个柱的系统在两个状态CCL和BL 之间切换时，CC道的所有柱成为“分批道”的柱，所有“分批道”的柱成为CC道的柱。两个道的局部切换时间等于总体切换时间t*。这使得整个过程连续。分批柱和逆流柱同时在同一机械中操作。本文呈现的发明提供与上述方法相比改进的分离方法，允许将混合物以连续或不连续的方式分离成4个或更多级分。该方法包括多个柱，其被分成以并行和/或顺序方式完成不同任务的区段。这些区段可以以特定方式通过阀门流体连通或断开。本发明尤其涉及通过至少4个单独的色谱柱连续或准连续地纯化多成分混合物 Fd的方法，其中通过至少一种溶剂使所述混合物通过所述色谱柱，其中所述多组分混合物 Fd将被分离成整数η个级分Fi,其中η至少为5。柱被分成至少6个区段，α ρ . . .，α η_3、β ρ . . .，β η_3、γ、δ，其中每个区段包括至少一个柱，前提是多个区段的功能也能依次实现并由单个柱实现。功能并行地或顺序地完成，其中后一种情况中，单个柱可承担一个步骤(例如CCL)中一个区段的功能和下一个步骤(例如BL)中的另一个功能。至少两个收集区段Ci1,...，α η_3各自有至少一个溶剂入口，并各自有至少一个居间组分F2, ...，Fn_2的出口，这样它们各自将相应居间组分洗出系统，但将较强吸附组分保留在区段αι，...，αη_3中。
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至少两个再循环区段β1;...，βη_3各自有至少一个溶剂入口，并各自有至少一个与后续的下游再循环区段的入口相连(或当后续的下游再循环区段不存在时，连接到进样区段S中)的出口，从而它们各自将相应被较强吸附组分污染的居间吸附组分通过所述出口洗入后续的下游再循环区段，或当后续的下游再循环区段不存在时，洗入所述进样区段 δ中，但是各自将相应待通过级分F1,. . .，Fn_3洗脱的较强吸附组分保留在对应的再循环区段 βρ...，βη_3 中。强吸附组分收集区段Y具有至少一个溶剂入口，还具有最强吸附组分出口(组分 F1)，从而通过所述出口洗出包含最强吸附成分的组分K。进样区段δ具有至少一个入口以接收最下游再循环区段β η_3出口的输出，还具有至少一个多组分混合物Fd的进样入口以及至少一个至少用于最弱吸附组分(级分Flri， Fn)的出口，这样将弱吸附组分在级分Fn_i、Fn中洗出系统，但将较强吸附的居间吸附组分的级分F2，...，Fn_2保留在区段δ中。其中区段α ρ . . α η_3、β ^ . . β η_3、γ、δ的功能可同时完成或依次完成。柱至少以一个分批模式位置(其中至少两个收集区段柱α” ...，αη_3用于收集居间级分F2,...，Fn_3)和至少一个相互联系的(连续或准连续模式)位置(其中至少两个再循环区段柱β1;...，βη_3的出口与对应的后续下游再循环区段的入口流体连通，或在没有后续的下游再循环区段时，连入所述进样区段中)运行。分批模式和连续或准连续模式可同步或依次地实现。在切换时间t*中，柱的位置向与溶剂的总体流动方向相反的方向移动。在切换时间t*之后或之中，每个区段组α ρ . . αη_3中的第一个柱(以溶剂流动的方向)移动到对应的再循环区段β ” . . β η-3的最后一个位置(以溶剂流动的方向)，最上游的再循环区段的第一个柱^移动到强吸附成分收集区段Y的最后一个位置，而其他再循环区段β 2. . . β η-3的第一个柱移动到了下一个上游收集区段α ” . . α η_4的最后一个位置， 强吸附组分收集区段Y的第一个柱移动到进样区段δ的最后一个位置，而进样区段δ的第一个柱移动成为最下游的收集区段αη_3的最后一个柱。如果区段分组(例如Y，β i ； α ” β 2 . · ； α η_3, δ g ； δ f, δ r)通过单个柱来实现， 则单个区段的功能和亚功能依次实现，在一次切换时间t*中交替进行连续或准连续洗脱的步骤和分批洗脱的步骤。如果没有这样的分组，则这些功能并行地实现。为了清楚无疑地理解整个本公开内容中的术语，应给出了术语的如下定义多组分混合物命名为Fd (进样)，是液体载体中m种组分K的混合物。多组分混合物作为进样引入到该过程中，并将在本发明的纯化方法中被分成η个级分(其中m大于或等于η)。级分是在色谱过程中确定的步骤中取出的确定体积。在理想的情况下，级分可以仅包含单一组分。然而，在实践中级分通常包含超过一种组分。在每个级分基本上仅有一种单一组分的情况下，η种组分的多组分混合物被分离成η个级分，每个基本上仅包含一种单一的组分。级分以指数η编号，在本文献中，指数最小的级分F1代表包含最强吸附组分的级分，而指数最大的级分Fn代表包含最弱吸附组分的级分，而级分F2, ...，Flri代表中等吸附级分或包含居间组分的级分，这些级分是所提出方法中的主要兴趣所在。强吸附组分是存在于多组分混合物中的高保留(retention)的组分，从而在色
12谱系统中，这些组分与固体固定相更坚固或更强地相互作用，因而在色谱过程的后期阶段中被洗脱。强吸附组分经常也被称为重组分，尽管事实上保留一般与分子量没有联系，所以，在该色谱过程中，重组分并不一定是分子量高的组分。弱吸附组分是存在于多组分混合物中的低保留的组分，从而在色谱系统中，这些组分与固相仅轻微地相互作用，因而在常规色谱过程的早期阶段中被洗脱。弱吸附组分经常也被称为轻组分，尽管事实上保留一般与分子量没有联系，所以，在该色谱过程中，轻组分并不一定是分子量低的组分。区段是色谱过程的一个部分或更确切的说一种功能(命名为Ci1, ...，αη_3, β1;...，βη_3，Y, δ)0区段的功能可由一个柱实现，或由依次或并行排列的多个柱实现， 其中当依次排列时，它们一般至少部分地相互连接。关于“柱”这一表述，需要注意的是，可以应用膜吸附剂或其它利用吸附原理的固定相来代替柱或与柱联用。正如描述的那样，区段的功能可在全部时间中(同步地)实现，其中每个区段至少有一个柱。然而，区段的功能也可依次实现，所以步骤(例如分批步骤或连续步骤)可交替，其中柱交替地实现不同区段的功能。例如，对于两个不同的时间范围(CCL和BL)中柱的功能不同的情况，区段中可以有一半数量的柱，因为每个柱在两个不同的步骤中实现不同的功能。然而，如果柱在超过两个步骤中完成不同的功能，那么更少的柱是可能的。如果在区段(或亚区段)的上下文中提到柱的“第一”位置，那么对于一个区段中的一排相互联系的柱的情况，这是指按流动相流动的方向，所以，区段中的第一个柱是区段中最上游的柱，而最后一个是最下游的柱。亚区段是一个区段的一部分或者更确切的说一个亚功能(例如δ的亚区段命名为δ g ; δ ρ δ r)。亚区段的功能可由一个柱实现，或由几个可依次或并行排列的柱来实现， 其中对于依次排列的情况，它们一般相互连接。亚区段的功能可在全部时间中(同步地)实现，在这种情况下每个亚区段至少一个柱。然而亚区段的功能也可依次实现，所以步骤(例如分批步骤和连续步骤)可交替进行，其中柱交替实现不同亚区段的功能。准连续洗脱术语准连续洗脱应指这样的步骤，其中至少两个柱相互连接，但其中也有柱以分批模式运行。这如图8中名为恥的柱所示。所以，准连续模式位置是这样的位置至少一个区段的出口与至少一个其他区段的入口流体连通。流动相(经常称为溶剂或液体)可使用液体、气体或超临界流体及其混合物作为流动相(洗脱液)。柱中洗脱液的组成在该过程的两个或更多个区段中和在各区段的柱中可以不同或相同。特别地，可以运行梯度。考虑到上述内容，如果选择所有区段的功能在任何时间都由至少一个柱实现的设置，则需要6个柱ΟΧα，2Χβ，y, 5g, 5f, δ》。这可参见图3，其中区段δ仅有一个柱，而非三个。如所提及，这些功能也可依次实现，那么最小柱数为4( α - β ;α - β ； δ - δ ;y - δ ；其中箭头表示当从BL转变为CCL时，该功能由同一个柱承担)。这可参考

图12，其中区段δ仅有2个柱，而非3个。与上述引用的US 5, 093, 004的现有技术相比，本申请的核心特征之一是所谓的短回路，即离开柱的流不一定进入下游的下一个区段，而是进入下一个柱之后的柱，参见例如图3。关于常规的模拟液相和固相逆流操作与“短回路”操作之间的差异的详细讨论可在 WO 2006/116886 中找到。US 5，093，004与本申请的其他区别为(仅列出少数)
·本发明涉及将进样混合物分离成至少5个级分(参见权利要求1)，而US 5，093，004仅考虑分离成3个级分(权利要求1)。-US 5，093，004不包含任何本文要求保护的区段α (仅有溶剂入口和用于整体离开系统的居间组分的出口)、区段S f (仅有进样口和用于整体离开系统的级分的出口)、区段Y (仅有溶剂入口和用于最终洗脱级分整体离开系统的出口)。根据第一个优选的实施方案，具有至少两个亚功能的进样区段δ (包括至少两个柱)具有至少一个入口用于接收最下游再循环区段β η_3出口的输出，还具有至少一个或两个入口用于接收多组分混合物Fd，以及至少两个用于最弱吸附组分(级分Fn_1;Fn)的出口， 从而将最弱吸附组分在Fn_i、Fn级分中洗出系统，而将级分F2, ...，Fn_2 (以及F1)的较强吸附的居间吸附组分保留在区段δ中。各区段的功能和亚功能(例如，γ，β ； α , δ g ； δ fa, δ ； δ fc, δ r)依次实现，所述分批模式和所述连续或准连续模式可依次实现。在准连续洗脱的步骤中，再循环区段的柱在此情况下与进样区段第一个柱δ g的入口流体连通，进样区段第一个柱\的出口与进样区段的最后一个柱、的入口流体连通，而进样区段的第二个居间柱δ fb在分批模式中用其入口作为多组分混合物Fd的进样入口，而在分批洗脱的步骤中，强吸附组分收集Y的柱、收集区段α的柱以及进样区段的第1个和第3个Sf。柱以分批模式运行，至少进样区段的第1个柱S &以其入口作为多组分混合物Fd的进样口运行。这些区段或亚区段各自可使用一个或多个柱。根据另一优选的实施方案，将区段的顺序功能对组合在一个柱中，其中在一次切换时间之内，连续或准连续洗脱的步骤和分批洗脱的步骤(以顺序的方式完成这些功能) 发生交替，其中的进样区段包括三个亚区段，而其中在整个系统中仅提供4个柱(或者层叠或成排的柱)，这四个柱在一个切换时间的第一部分中在连续或准连续洗脱步骤(CCL) 中依次连接，并在切换时间的第二部分中在成批步骤(BL)中被驱动而输出多组分混合物 (Fd)中的单个级分F1,...，Fn_lt)这是例如图7所示并在下文中更细致地讨论的过程。根据另一优选的实施方案，将区段的顺序功能对组合在一个柱中，其中在一次切换时间内，连续或准连续洗脱的步骤和分批洗脱的步骤(依次实现那些功能)发生交替， 其中进样区段包括至少5个亚区段，而其中在完整系统中仅提供5个柱(或层叠或成排的柱)，其中的4个在一次切换时间内第一部分中在(准连续洗脱的)CCL步骤中依次连接，并在切换时间的第二部分中在分批(BL)步骤中被驱动而输出多组分混合物(Fd)中的单个级分F1, ...，Fn_lt)这是例如图12所示的过程，其允许连续和基本不间断地进样，因为进样区段的第五个柱(以恥表示)在CCL步骤中以分批模式运行(因为在进样区段中提供了一个在准连续洗脱中以分批模式运行的柱)。根据另一优选的实施方案，区段Y，β工；α ρ β 2 . . ； α η_3，δ g ； δ f, δ r的功能和亚功能依次实现，且所述分批模式和所述连续或准连续模式依次实现，其中在连续或准连续洗脱步骤中，再循环区段的柱与下一个下游再循环区段流体连通，或者与进样区段的第1 个柱S 8的输入流体连通，进样区段第一个柱\的输出与进样区段的最后一个柱、的输入流体连通，并且在分批洗脱步骤中，强吸附组分收集区段Y的柱、收集区段α的柱和进样区段的柱Sf以分批模式运行，进样区段的柱Sf以其入口用于多组分混合物Fd的进样而运行，其中优选有两个收集区段和两个再循环区段，并且该方法用4个柱实现，或者有三个收集区段和三个再循环区段，并且该方法用6个柱实现。
很独立地，本发明进一步地涉及通过至少4个单独的色谱柱对多组分混合物Fd进行连续或准连续纯化的方法，所述混合物通过至少一种溶剂进样而通过所述色谱柱，其中所述多组分混合物Fd将被分离成整数η个级分1 ，其中η至少为6。需要注意的是该方法 (其允许连续地进样并在将柱引入纯化过程之前非常高效地清洗柱)不依赖于上述多组分纯化方法和发明，并且本身与现有技术相比具有新颖性和创造性。特别地，在这一方法中，柱被分组为至少4个区段α、β、Y, δ，其中至少一个收集区段α”.. αη_3各自具有至少一个溶剂入口和至少一个用于居间级分F2...Fn_2的出口，以使其各自将相应的居间级分F2. . . Fn_2洗出系统，但将较强吸附组分保留在该区段 αι，...，α η_3中，至少一个再循环区段β”, β η_3具有至少一个溶剂入口，还具有至少一个出口，其连接到后续下游再循环区段的入口，或是当后续下游再循环区段不存在时，连接到进样区段δ中，以使其将被要通过级分F1... Fn_3洗脱的较强吸附组分污染的要在居间级分F2. . . Fn_2中洗脱的相应居间吸附组分通过所述出口洗到后续的下游再循环区段中，或者当后续的下游再循环区段不存在时，洗到所述进样区段δ中，但将要在级分F1... Fn_3中洗脱的相应(纯的)较强吸附组分保留在对应的再循环区段β”., β η_3中，强吸附组分收集区段(Y)具有至少一个溶剂入口和一个最强吸附组分(级分F1)的出口，以使其通过所述出口将最强吸附组分在级分F1中洗出，其中包含至少两个柱的进样区段δ具有至少一个入口以接收最下游再循环区段β η-3出口的输出，并具有至少一个或两个用于多组分混合物 Fd进样的入口和至少两个用于至少两个最弱吸附级分Fn_”Fn的出口，以使其将弱吸附组分在级分Fn_i、Fn中洗出系统，但将级分F2、Fn_2 (和F1)中的较强吸附的居间吸附组分保留在区段δ中，其中区段γ，β ； α , δ g ； δ fa, δ ； δ fc, δ r的功能和亚功能依次实现。柱在至少一个分批模式位置中运行(其中至少一个收集区段柱α ” . . α n_3的出口用于收集居间级分 F2. . . Fn_3)，并在至少连续或准连续模式位置运行(其中至少一个再循环区段柱β ” . . β n_3 的出口与对应的后续下游再循环区段的入口流体连通，或者当后续的下游再循环区段不存在时，流体连通到所述进样区段中，其中所述分批模式和所述连续或准连续模式依次实现。在切换时间t*之后或之中，柱向与溶剂总体流动方向相反的方向移动位置。在切换时间t*之后或之中，收集区段α ” . . α n_3的第一个柱移动到对应的再循环区段β i. . . βη_3的最后一个位置，最上游再循环区段β ！的第一个柱移动到强吸附组分收集区段Y的第一个位置，其他再循环区段β2... βη_3 (如果有的话)的第一个柱移动到下一个上游收集区段α ” . . α η_4的最后一个位置，强吸附组分收集区段Y的第一个柱移动到进样区段δ的最后一个位置，进样区段δ的第一个柱移动成为最下游收集区段αη_3的最后一个柱。区段的分组Y，β 丨；α β 2 ;· · · ； α η_3，δ g ； δ fa，δ ，； δ f。，δ r 通过单个柱实现， 单个区段的功能或亚功能通过在一个切换时间t*内使连续或准连续洗脱步骤和分批洗脱步骤交替进行而依次实现，其中在连续或准连续洗脱的步骤中，再循环区段的柱与进样区段第一个柱S 8的输入流体连通，进样区段第一个柱S 8的输出与进样区段最后一个柱5r 的输入流体连通，而进样区段的第二个居间柱Sfb以分批模式运行，将其入口用于多组分混合物Fd的进样，并且其中在分批洗脱的步骤中，强吸附组分收集区段γ的柱、收集区段 α的柱和进样区段的第1个柱δ &和第3个柱Sf。以分批模式运行，进样区段5fa、5fb> δ fc中至少一个柱在运行时将其入口用于多组分混合物Fd的进样。
在这种情况下，仅用四个柱的方法是特别有优势的。根据本方面的一个这种优选的实施方案，区段(Y，β ； α，δ g ； δ fa，δ ； δ f。，δ r)的功能和亚功能依次实现(参见图 8)，所述分批模式和所述连续或准连续模式依次实现，其中在准连续洗脱的步骤中，单个再循环区段的柱与进样区段第一个柱\的输入流体连通，进样区段的第一个柱\的输出与进样区段最后一个柱、的输入流体连通，而同时进样区段的第二居间柱(Sfb)以分批模式运行，将其入口用于多组分混合物(Fd)的进样，出口用于收集级分(F4)，在分批洗脱的步骤中，强吸附组分收集区段Y的柱、收集区段α的柱和进样区段的第一个和第三个居间柱 (δ 3, 5fc)以分批模式运行，将其入口中的至少一个用于多组分混合物Fd的进样。在这种情况下也可有两个再循环区段，使得总共有5个柱。下文优选的实施方案涉及上边提到的两种方法，也涉及多组分纯化方法和允许连续进样的方法。根据一个优选的实施方案，进入至少一个区段的溶剂的组成在切换时间(t*)内基本连续地变化，和/或对于超临界溶剂的情况，进入至少一个区段的超临界溶剂的密度在切换时间(t*)内基本连续地变化。根据另一个优选的实施方案，进入至少一个(或优选所有)区段的溶剂的组成通过提高或降低改性剂浓度而在切换时间(t*)内基本连续地变化，和/或对于超临界溶剂情况，通过提高或降低密度而切换时间(t*)内发生密度改变，其中沿着柱的顺序，从最下游 (δ)到最上游(α)区段，改性剂浓度(Cnrod)/密度以这样的方式增加或降低柱移动后，每个柱的改性剂浓度(Cnrod) /密度基本为柱的新位置处的基本改性剂浓度/超临界溶剂密度， 并使得在接下来的切换时间(t*)内，每个柱内部的改性剂浓度/密度提高或降低至柱再移动后下一个位置的基础浓度/密度。在每个溶剂入口处，可提供具有各自恒定的基础浓度(Cm。d,。)的改性剂的溶剂，其中向多个入口提供流速和/或组成变化(优选变化改性剂的浓度(cm。d,v))的溶剂流，并与具有各自恒定的改性剂基础浓度(Cm。d,。)的溶剂混合，以在系统中建立梯度。进入所有或某些区段中的溶剂可在切换时间(t*)中线性或准线性或非线性地基本连续地改变组分和/或密度，其中优选以这样方式改变改性剂浓度。进样区段可包括分成三个亚区段的至少三个柱，或依次提供这些亚区段功能的更少的柱，其中第一个亚区段 、包括至少一个用于多组分混合物进样(优选低于系统中整体流速的流速)的入口，以及至少一个用于级分Flri的出口，其中第二个亚区段δ 8包括至少一个入口用于接收最下游再循环区段β η_3的输出，以及与第三个亚区段、的至少一个入口相连的至少一个出口。第三个亚区段δ r可包含至少一个入口以接收第二个亚区段δ g的输出，以及至少一个用于级分FnW出口。在切换时间(t*)之后或之内，第一个亚区段(δ f)的第一个柱移动到第二个亚区段(Sg)的最后一个位置，第二个亚区段(Sg)第一个柱移动到收集区段的最后一个位置， 强吸附组分收集区段(Y)的第一个柱移动到第三个亚区段(S》的最后一个位置，而第三个亚区段(δ r)的第一个柱移动成为第一个亚区段(δ f)的柱，区段的功能可同步实现或依次实现。区段的顺序功能配对可组合在一个柱中，其中在一次切换时间之内，连续或准连续洗脱的步骤和分批洗脱的步骤(以顺序的方式实现这些功能)交替进行。进样区段可包含三个亚区段，在完整的系统中可提供4个柱，这四个柱在一个切换时间的第一部分中在连续或准连续洗脱步骤(CCL)中依次接，并在切换时间的第二部分中在分批步骤(BL)中被驱动，以输出多组分混合物(Fd)的单个级分(F1... Flri)。如上述描述的所有区段那样，这一特定情况中的第一个亚区段可包含至少两个并行的柱，和/或第二和/或第三个亚区段可包含至少两个逆流并行的或顺序的柱。进样可以是连续的、脉冲式的或在一个切换时间(t*)内具有特定的浓度/密度谱线形状的，和/或其中溶剂流在一个切换时间(t*)内变化和/或其中单个入口 /出口的切换在一个切换时间(t*)内进行。单个柱的流速可相同或不同。此外，本发明涉及用于进行任何上述方法的设备。该设备的具体细节在相应的权利要求中定义。一般这样的设备包含至少4个，优选至少5个独立的色谱柱的拓扑结构。本发明的其他实施方案在从属权利要求中列出。附图简述下面参照附图来描述本发明的一些优选实施方案，目的是说明(而不是限制)本发明的本优选实施方案。在附图中，图1展示了使用6个柱进行连续纯化方法的流程图；图2展示了不连续的6个柱的单元，具有逆流道和分批道，其中a)给出了按顺序的展示，而b)是将分批道(batch lane, BL)和逆流道(countercurrent lane, CCL)显示为单个步骤的图；图3展示了连续多级分分离方法的图表；图4展示了连续多级分分离方法的一般流程图；图5展示了连续的5级分分离方法的流程图；图6展示了连续的6级分分离方法的流程图；图7展示了逆流道(CCL)和分批道(BL)相互联系的不连续多级分分离方法的图表；图8展示了连续进样的不连续4柱方法的图表；图9展示了连续进样的连续4柱方法的流程图；图10展示了带有清洗区段/连续进样的连续多级分分离方法的图表；图11展示了具有清洗区段/连续进样的连续多级分分离方法的流程图；图12展示了有清洗区段和连续进样的逆流道(CCL)和分批道(BL)相互联系的不连续多级分分离方法的图表；图13展示了有清洗区段和连续进样的逆流道(CCL)和分批道(BL)相互联系的不连续多级分分离方法的流程图；图14展示了在切换时间结束时和柱切换之前，柱内部组分的内部液相浓度谱。优选实施方案的描述图2a)中展示了根据现有技术(尤其是WO 2006/116886)所定义的6个柱的设置， 并在图上指明了由每个单个柱所涵盖的区段。图2的装置的一般拓扑学情况见图1。各区段具有特定的任务，它们是区段α 将纯化的居间产物洗出系统，但将强吸附杂质保留在该区段内。区段β :将被强吸附杂质污染的居间产物洗入区段δ，但将强吸附杂质保留在该区段中。区段Y 洗出强吸附杂质并清洗该区段的色谱柱。原位清洗(cleaning in place, CIP)。区段δ 将弱吸附杂质洗出系统，但在将所期望的产物保留在该区段中。使进样进入纯化系统。在图2中的情况下，下述任务通过以下编号的柱完成1.使所有的强吸附杂质C离开柱2.使所有的居间产物B离开该柱，但保留强吸附杂质C在该柱中3.确保仅有居间产物B，而没有强吸附杂质C离开该柱4.使所有弱吸附杂质A离开柱，但保留居间产物B在柱中5.使进样Fd进入柱，并使第一弱吸附杂质A离开柱6.确保没有居间产物B离开柱，并从柱中除去示踪剂。在图2b)中，6个柱的设置被分成3个相互联系的柱和3个不相互联系的柱，与图 2a)中的6个柱的设置一致。三个相互联系的柱的道被称为“CCL”(逆流道)而不相联系的柱的道称为“BL”(分批道)。CCL由柱位置2、4、6(β，δ g，δ》组成，而分批道由柱位置1、3、5 ( γ，α , δ f)组成。很明显，当6柱系统在CCL和BL两个状态之间切换时，所有CC道的柱变成“分批道”的柱，而所有分批道的柱变为CC道的柱。两个道之间的局部切换时间等于总切换时间t*。这使得整个过程是连续的。分批柱和逆流柱同时在同一机械中运行。在此展示的本发明提供与图1和2中所示相比改善的分离方法，其允许以连续或不连续的方式将混合物分离成4个或更多个级分。该方法包括多个柱，其分组为以并行和 /或顺序的方式完成不同任务的区段。区段可以特定方式通过阀流体连通或断开。一般地，要注意的是在图3和4的情况中，η是整数，并代表级分数。η大于或等于 5。i是指数，从5开始，随括号中给出的单元的重复而增加。m是组分K的数目并大于或等于n。F代表级分。在图5的情况下，η选为等于5，因此i等于5，在图6的情况中，η选为等于6，而结果i取值5和6。在图10的情况下，η选为大于或等于6，指数i始于5，而对图11同样成立。在图12的情况中，η大于或等于7，而对图13同样成立。柱被分组为区段Υ，α，β和δ。区段α和β代表该方法的一对居间区段，其可重复以使该方法可将进样混合物分离成更多的级分。通过重复该区段对(α，β)，区段 α被连接到下一个重复对(α，β)的区段α。最后一个重复对(α，β)的区段α连接到区段δ。该过程中(α，β)对的数目通过第一对(α，β)和至少一个更多的重复对(α， β)给出。每个(α，β)对产生一个级分，其可根据从区段中洗脱的顺序进一步分级分离。区段Υ包含一个流体入口，并产生一个可基于洗脱顺序被进一步分级分离的级分。区段δ产生至少两个级分(所述级分可基于洗脱顺序被进一步分级分离)，并包含至少一个流体入口。在区段δ中，施加由至少4种保留行为不同的不同组分组成的进样混合物。区段S包含至少一个所述进样混合物应用柱和两个流体连通的柱。流体连通的区段α和δ的目的是使部分纯化的组分进行内部循环，以进一步纯化和获得高产率的组分。在给定的切换时间阶段之后或之中，该方法的柱以与流体流相反的方向切换，这导致固定相和流动相按δ，β，α，Y的顺序模拟逆流运动。与内部再循环相联合，这导致产物级分的高纯度。区段Y和β的目的是产物和/或杂质级分的洗脱。如图3中所示方法的连续实施方案中，区段γ，α，β和δ的任务以并行等方式完成，在切换时间之后或之中，柱以δ，β，α，Υ，δ，的顺序前进，依此类推。柱的移动示于在图4中显示的本实施方案的流程图中。图5的流程图给出了本实施方案的有1个重复对(α，β)的5级分分离(η = 5)的实例。图6中的流程图给出了本实施方案的有2个重复对(α，β )的6级分分离(n = 6)的实例。在图7所示方法的不连续的实施方案中，区段α和δ的任务并行进行，各区段流体断开。切换时间之后或之中，区段α的柱向区段γ的方向切换，并完成之前的重复对 (α, β)中区段β的任务。区段的第一个柱切换到区段Y中最后一个柱的位置。同时，区段δ的第一个柱切换到最后一个重复对(α，β)中区段α的最后一个柱的位置。 在区段δ中，柱以亚区段从6到5、从5到4的顺序切换。本文所述的发明也提供了改进的纯化方法，其允许以不连续方式将混合物分离成 4个级分，其中包含所述混合物的进样以连续方式施加。本方法包含4个柱，其分组成以并行或顺序方式完成不同任务的区段。在图8中描述的特定的方式中，区段可通过阀门流体连通或断开。柱被分组成区段γ，α，β和δ。区段Υ包含一个流体入口，并产生一个可基于洗脱顺序进一步分级分离的级分。区段δ产生至少两个可基于洗脱顺序进一步分级分离的级分，并包含至少一个流体入口。将由至少4种不同保留行为的不同组分组成的进样混合物进样到区段δ中。区段S包含至少一个所述的进样混合物进样柱和两个流体连通的柱。流体断开的区段α和δ的目的是使部分纯化的组分内部再循环，以进一步纯化和获得高产率组分。切换时间阶段之后或之中，该方法的柱以与流体流相反的方向切换，这导致固定相和流动相按δ，β，α，Υ顺序的发生模拟逆流运动。与内部再循环相组合，这导致产物级分的高纯度。区段γ和β的目的是洗脱产物和/或杂质级分。来自Y和β的级分可基于组分从区段洗脱的顺序进一步分级分离。在图8所示方法的实施方案中，区段Υ，α，β和δ的任务在切换时间之后和之内依次实现，柱按δ，β，α，Υ，δ的顺序前进，依此类推。图9的流程图中图示了柱的移动。区段α，Υ，β中的每一个在一个循环δ，β，α，Υ中通过至少一个柱。区段δ 在每个给定的时间点包含至少2个柱。也可使用膜吸附剂或其它利用吸附原理的固定相来代替柱。液体或超临界流体可用作流动相。柱中洗脱液的组成可以在本方法的两个或多个区段中以及在所述区段的柱中相同或不同。特别地，可运行梯度。当然，这一概念可与上文定义的多组分分离方法相联合，反之亦然。在图10所示的连续的实施方案中，区段δ的亚区段的柱以64b-5a-4的顺序切换。这一实施方案展示了对区段S进行了修改的方法，其中加入了包含至少一个柱的区段
195b，目的是清洗或额外进样。清洗或进样的第一区段以fe表示。对应的流程图在图11中给出。在图12所示的不连续的实施方案中，区段δ的亚区段的柱以6-5c-5b-fe_4顺序切换。清洗或进样的三个区段以如，5b，5c表示。区段α、Y、β中每一个包含至少一个柱。在图3、图5、图6和图7的情况下，区段δ包含至少两个柱；在图12和图13中所示的情况下包含3个柱；在图10和图11的情况下包含4个柱。可使用膜吸附剂或其它利用吸附原理的固定相来代替柱。液体或超临界流体可用作流动相。柱中洗脱液的组成在本方法的两个或多个区段中以及在区段的柱中可不同或相同。特别地，可运行梯度。下面，应用图5所示流程图给出分离成5个级分的例子。该模拟是基于应用多组分竞争性1 angmu i r等温式的集总动力学模型 (lumped-kinetic model)。假定Henry系数H是改性剂(组分1)浓度Cm的幂函数H = a*cMb，而参数a和b和等温饱和容量在表Tl中给出表Tl:
权利要求
1.通过至少四个独立的色谱柱对多组分混合物(Fd)进行连续或准连续纯化的方法， 所述混合物通过至少一种溶剂进样到所述色谱柱中，其中所述多组分混合物(Fd)将被分离成整数η个级分(Fi)，其中η至少为5，其中柱被分组成至少6个区段(Ci1, ... αη_3、^1... βη_3> Υ> S)，其中每个区段 (Q1... α η_3、β . . β η_3、γ, δ)包含至少一个柱，前提是几个区段的功能可依次实现并可用单个柱实现， 其中至少两个收集区段(α”.. αη_3)各具有至少一个溶剂入口和至少一个用于洗脱在级分(F2...Fn_2)中的居间吸附组分的出口，以使它们各自将相应的居间级分(F2...Fn_2)洗出系统，而将较强吸附的组分保留在所述区段中(α”.. αη_3)；至少两个再循环区段(β”. βη_3)各自具有至少一个溶剂入口，并各自具有至少一个出口，其连接到后续下游再循环区段的入口，或者在没有后续下游再循环区段的情况下连接到进样区段(S )中，以使它们各自通过所述出口将被要通过级分F1. . . Fn_3洗脱的较强吸附组分污染的相应居间吸附组分洗到后续下游再循环区段中，或是当后续下游再循环区段不存在时洗到所述进样区段(δ )中，但各自将待洗出的相应较强吸附组分(F1,. . .，Fn_3)保留在对应的再循环区段(β ” . . βη_3)中；强吸附组分收集区段(Y)具有至少一个溶剂入口以及用于将洗脱在级分(F1)中的最强吸附组分的出口，以使其通过所述出口洗出级分(F1)；进样区段(S)具有至少一个入口以接收最下游再循环区段(βη_3)的出口的输出，还具有用于多组分混合物(Fd)进样的至少一个入口和用于至少两个最弱吸附级分(Fn_i、Fn) 的至少一个出口，以使其在级分Fn_” Fn中将弱吸附组分洗出系统，但将较强吸附的居间吸附组分的级分F1... Fn_2保留在区段δ中，其中区段(Q1... αη_3、P1... βη_3、Y、δ)的功能同步实现或依次实现， 其中柱在至少一个分批模式位置运行，其中至少两个收集区段柱(α”.. αη_3)的出口用于收集居间级分(F2, ... , Fn_2)，以及在至少连续或准连续模式位置运行，其中至少两个再循环区段柱(β”.. βη_3)的出口与对应的后续下游再循环区段的入口流体连通，或者当后续下游再循环区段不存在时流体连通到所述进样区段中，其中所述分批模式和所述连续或准连续模式同步实现或依次实现， 其中在切换时间(t*)之后或之内，所述柱的位置向与溶剂总体流动方向相反的方向移动，并且其中在切换时间(t*)之后或之内每个收集区段(α”.. αη_3)的第一个柱移动到对应再循环区段(β”.. βη_3)的最后一个位置处，最上游再循环区段(P1)的第一个柱移动到强吸附组分收集区段(Y)的最后一个位置，其他再循环区段(β2... βη_3)的第一个柱移动到下一个上游收集区段 (Q1... α η_4)的最后一个位置，强吸附组分收集区段(Y )的第一个柱移动到进样区段(δ ) 的最后一个位置，且进样区段(S)的第一个柱移动成为最下游收集区段(αη_3)的最后一个柱，其中如果区段分组(Y，βι;α17 β 2 ； α 2. . . ;αη_3，δ g ； δ f, δ r)通过单个柱实现，则单个区段的功能和/或亚功能通过使连续或准连续洗脱步骤与分批洗脱步骤在一个切换时间(t*)之内进行交替而依次实现。
2.根据权利要求1的方法，其中包含至少两个柱的所述进样区段(δ)具有至少一个入口以接收最下游再循环区段(βη-3)的出口的输出，还具有用于多组分混合物(Fd)进样的至少两个入口以及用于至少两个最弱吸附组分级分(Fn_i、Fn)的至少两个出口，以使其将弱吸附组分在级分Fn_i、Fn中洗出系统，但将要通过级分(F2...Fn_2)洗脱的较强吸附的居间吸附组分保留在区段δ中，其中区段(Y，β ； α , δ g ； δ fa, δ δ fc, δ r)的功能和亚功能依次实现，并且其中所述分批模式和所述连续或准连续模式依次实现，并且其中在准连续洗脱的步骤中，再循环区段(βη_3)的至少一个柱与进样区段的第一个柱(Sg)的输入流体连通，进样区段的第一个柱(Sg)的输出与进样区段的最后一个柱 (δΓ)的输入流体连通，而进样区段的第二居间柱(Sfb)以分批模式运行，其中将其入口用于多组分混合物(Fd)的进样，并且其中在分批洗脱的步骤中，强吸附组分收集(Y)的柱、收集区段(α)的柱和进样区段的第一个(δ fa)和第三个(δ fc)柱以分批模式运行，进样区段(δ fa、δ ft、δ fc)的至少一个入口用于多组分混合物(Fd)的进样。
3.根据权利要求2的方法，其中区段的顺序功能配对被组合在一个柱中，其中在一个切换时间内，依次实现所述功能的连续或准连续洗脱步骤与分批洗脱的步骤交替进行，其中所述进样区段包含三个亚区段(Sg、5f> δ》，并且其中在整个系统中提供了 4个柱，这 4个柱在一次切换时间的第一部分中在连续或准连续的洗脱步骤(CCL)中依次连接，并在该切换时间的第二部分中以分批步骤(BL)驱动，以输出多组分混合物(Fd)的单个级分(F” · · Fn—ι) ο
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中区段(Li^1;α ^ii2;... ； αη_3, 5g;5f, δ r)的功能和亚功能依次实现，并且其中所述分批模式和所述连续或准连续模式依次实现，其中在连续或准连续洗脱步骤中，再循环区段的柱与下一个下游再循环区段流体连通，或与进样区段的第一个柱(Sg)的输入流体连通，进样区段的第一个柱(Sg)的输出与进样区段的最后一个柱(、)的输入流体连通，并且其中在分批洗脱步骤中，强吸附组分收集(Y)的柱、收集区段(α)的柱和进样区段的柱(Sf)以分批模式运行，进样区段的柱(Sf)将其入口用于多组分混合物(Fd)的进样来运行，其中优选地，有两个收集区段和两个再循环区段且该方法应用4个柱实现，或者有3个收集区段和三个再循环区段且该方法应用6个柱实现。
5.通过至少4个独立的色谱柱对多组分混合物(Fd)进行连续或准连续纯化的方法，所述混合物用至少一种溶剂进样而通过所述色谱柱，其中所述多组分混合物(Fd)将被分离成整数η个级分(Fn)，其中η至少为6，其中柱被分组成至少4区段(α、β、Y、δ )，其中至少一个收集区段(α ” . . α η_3)各具有至少一个溶剂入口和至少一个用于居间级分F2. . . Fn_2的出口，以使它们各自将相应的居间组分洗出系统，但将较强吸附组分保留在区段α ” . . α n_3中；至少一个再循环区段(^1... βη_3)具有至少一个溶剂入口，还具有至少一个出口，其连接到后续下游再循环区段的入口，或者当不存在后续再循环区段时连接到进样区段(δ ) 中，以使其通过所述出口将被要通过级分(F1. . . Fn_3)洗脱的较强吸附组分所污染的要在居间级分(F2...Fn_2)中洗脱的相应居间吸附组分洗到后续下游再循环区段中，或者当后续下游再循环区段不存在时，洗到所述进样区段(S)中，但将要在级分(Fi...Fn_3)中洗脱的相应较强吸附组分保留在对应的再循环区段(β . . .，βη_3)中；强吸附组分收集区段(Y)具有至少一个溶剂入口和用于最强吸附组分的级分(F1)的出口，以使其通过所述出口将最强吸附组分与级分(F1) —起洗出；包含至少三个柱的进样区段(S)具有至少一个入口以接收最下游再循环区段(βη_3) 的出口的输出，还具有用于多组分混合物(Fd)进样的至少两个入口和用于至少两个最弱吸附组分级分(Flri、！U的至少两个出口，以使其将弱吸附组分在级分(Flri、！U中洗出系统，但将用于级分(F2...Fn_2)的较强吸附的居间吸附组分保留在区段δ中， 其中区段(Y，β ； α，δ g ； δ fa，δ ； δ f。，δ』的功能和亚功能依次实现， 其中柱在至少一个分批模式位置中运行，其中至少一个收集区段柱(α”.. αη_3)的出口用于收集居间级分(F2... Fn_3)，还在至少一个准连续模式位置中运行，其中至少一个再循环区段柱(β”.. βη_3)的出口与后续下游再循环区段的对应入口流体连通，或者当后续下游再循环区段不存在时流体连通到所述进样区段中， 其中所述分批模式和所述连续或准连续模式依次实现，其中在切换时间(t*)之后或之内，柱的位置向与溶剂总体流动方向相反的方向移动， 并且其中在切换时间(t*)之后或之内收集区段(α”.. αη_3)的第一个柱移动到对应的再循环区段(β”.. βη_3)的最后一个位置，最上游再循环区段(P1)的第一个柱移动到强吸附组分收集区段(Y)的最后一个位置，并且如果存在的话，其他再循环区段(β2... βη_3)的第一个柱移动到下一个上游收集区段(α ” . . α η_4)的最后一个位置，强吸附组分收集区段(Y )的第一个柱移动到进样区段(S)的最后一个位置，而进样区段(δ)的第一个柱移动成为最下游收集区段(αη_3)的最后一个柱，其中区段分组(Y，β i ； α β 2 ；…；α η_3，δ g ； δ fa，δ fb ； δ f。，δ r)通过单个柱实现， 而单个区段的功能或亚功能通过在一次切换时间(t*)内使连续或准连续洗脱步骤和分批洗脱步骤交替进行而依次实现，其中在准连续洗脱步骤中，再循环区段的至少一个柱与进样区段的第一个柱(Sg)的输入流体连通，进样区段的第一个柱(Sg)的输出与进样区段最后一个柱(δ》的输入流体连通，进样区段的第二居间柱(Sfb)以分批模式运行，其中将其入口用于多组分混合物(Fd) 的进样，并且其中在分批洗脱步骤中，强吸附组分收集(Y)的柱、收集区段(α)的柱和进样区段第一个(S g)和第三个(δ r)柱以分批模式运行，进样区段(S ^ ； δ ； δ f。)的至少一个入口用于多组分混合物(Fd)的进样。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中进样到至少一个区段中的溶剂的组成在切换时间(t*)内基本连续地变化，和/或在超临界溶剂的情况下，进样到至少一个区段中的超临界溶剂的密度在切换时间(t*)内基本连续地变化。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中进样到至少一个或优选地所有区段中的溶剂的组成在切换时间(t*)内通过改性剂浓度的提高或降低而基本连续地变化，和/或在超临界溶剂的情况下，其密度在切换时间(t*)内通过密度的提高或降低而变化，而其中沿柱的顺序，从最下游(S)到最上游(α)区段，改性剂的浓度(Cm。d)/密度以这样一种方式提高或降低其使得柱移动后，每个柱的改性剂浓度(Cnrod)/密度基本为柱的新位置处的基础改性剂浓度/超临界溶剂密度，并使得在接下来的切换时间(t*)内，每个柱内部的改性剂浓度/密度提高或降低至柱再移动后下一个位置的基础浓度/密度。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中进样区段包含分成三个亚区段(Sg;Sf; δ r)的至少3个柱，或包含依次提供这些亚区段的功能的更少的柱，其中第一个亚区段(Sf)包含用于多组分混合物(Fd)进样的至少一个入口，优选地在低于系统中总体流速的流速下进样，还包含用于级分(Flri)的至少一个出口，其中第二个亚区段(Sg)包含至少一个入口用于接收最下游再循环区段(βη_3)的输出，还具有与第三亚区段(、)的至少一个输入相连的至少一个出口，其中第三个亚区段(δ r)包含至少一个入口用于接收第二个亚区段(δ g)的输出，还具有用于级分(Fn)的至少一个出口，其中在切换时间(t*)之后或之内，第一个亚区段(Sf)的第一个柱移动到第二个亚区段(Sg)的最后一个位置，第二个亚区段(Sg)的第一个柱移动到收集区段的最后一个位置，强吸附组分收集区段(Y)的第一个柱移动到第三个亚区段(、)的最后一个位置，第三个亚区段(δ r)的第一个柱移动成为第一个亚区段(δ f)的柱，并且其中区段的功能同步实现或依次实现。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中区段的顺序功能配对被组合在一个柱中， 并且其中在一次切换时间之内，依次实现这些功能的连续或半连续洗脱步骤和分批洗脱步骤交替进行。
10.根据权利要求9的方法，其中所述进样区段包含三个权利要求8所述的亚区段，并且其中在完整系统中提供4个柱，这4个柱在一次洗脱时间的第一部分中在连续或准连续洗脱步骤(CCL)中依次连接，而在切换时间的第二部分中在分批步骤(BL)中被驱动而输出多组分混合物(Fd)的单个级分(F1. · · Flri)。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中进样在一次切换时间(t*)内是连续的、脉冲式的或具有浓度/密度曲线形状，和/或其中溶剂流在一个切换时间(t*)内是变化的， 和/或其中各个入口 /出口的切换在一次切换时间(t*)内进行。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中各柱中的流速不同。
13.用于实施权利要求1-12中任一项所述方法的设备，其中提供至少4个、优选至少 5个单个色谱柱的拓扑学情况，所述混合物通过至少一种溶剂进样到所述色谱柱中，其中所述多组分混合物(Fd)将被分离成整数η个级分(Fi)，其中η为至少5，其中柱被分组成至少6个区段(Ci1... αη_3、β”. βη_3、Y、δ )，其中每个区段 (Ci1... αη_3、^1... βη_3> Υ> δ)包含至少一个柱，前提是区段的功能可依次实现，并且之后可用一个柱实现，其中至少两个收集区段(α”.. αη_3)各自具有至少一个溶剂入口和至少一个用于在级分 (F2. . . Fn_2)中洗脱的居间吸附组分的出口，以使它们各自将相应居间级分(F2, Fn_2)洗出系统，但将较强吸附组分保留在区段(α”.. αη_3)中，至少两个再循环区段(β”. βη-3)各自具有至少一个溶剂入口，并且各自具有至少一个出口，其连接到后续下游再循环区段的入口，或是当后续下游再循环区段不存在时，连接到进样区段(S )中，以使它们各自通过所述出口将被要在F1. . . Fn_3中被洗脱的较强吸附组分所污染的居间吸附组分洗到后续的下游再循环区段中，或者当后续下游再循环区段不存在时洗到所述进样区段(δ )中，但各自将要通过F1. . . Fn_3洗脱的纯的较强吸附组分保留在对应的再循环区段(P1... βη_3)中，强吸附组分收集区段(Y)具有至少一个溶剂入口和用于要在级分(F1)中洗脱的最强吸附组分的出口，以使其通过所述出口将级分(F1)洗出，进样区段(δ)具有至少一个入口以接收最下游再循环区段(βη-3)的出口的输出，还具有用于多组合混合物(Fd)进样的至少一个入口以及用于至少两个最弱吸附级分(Fn_i、Fn)的至少一个出口，以使其将弱吸附组分在级分Fn_i、Fn中洗出系统，但将较强吸附的居间吸附组分的级分F1. . . Fn_2保留在区段δ 内，其中区段(Q1... αη_3、P1... βη_3、Y、δ)的功能同步实现或依次实现， 其中柱在至少一个分批模式位置运行，其中至少两个收集区段柱(α”.. αη_3)的出口用于收集居间级分(F2. . . Fn_3)，以及在至少连续或准连续模式位置运行，其中至少两个再循环区段柱(β”.. βη_3)的出口与对应的后续下游再循环区段的入口流体连通，或者在后续下游再循环区段不存在时，流体连通到所述进样区段中，其中所述分批模式和所述连续或准连续模式同步实现或依次实现， 其中在切换时间(t*)之后或之内，所述柱的位置向与溶剂总体流动方向相反的方向移动，并且其中在切换时间(t*)之后或之内来自每个收集区段(α”.. αη_3)的第一个柱移动到对应的再循环区段(β”.. βη_3) 的最后一个位置，最上游的再循环区段(P1)的第一个柱移动到强吸附组分收集区段(Y) 的最后一个位置，其他再循环区段(β2... βη-3)的第一个柱移动到下一个上游收集区段 (Q1... α η_4)的最后一个位置，强吸附组分收集区段(Y )的第一个柱移动到进样区段(δ ) 的最后一个位置，进样区段(S)的第一个柱移动成为最下游收集区段(αη_3)的最后一个柱，其中如果区段分组(Y，^ ;αι，β2;... ； αη_3, δ g ； δ f, δ r)通过单个柱实现，则各个区段的功能和/或亚功能通过使连续或准连续洗脱步骤和分批洗脱步骤在一个切换时间 (t*)之内交替进行而依次实现。
14.用于实施权利要求1-12的任一项所述方法的设备，其中提供至少4个、优选至少5 个单个色谱柱的拓扑学情况，其中多组分混合物(Fd)将被分离成整数η个级分(Fi),其中 η为至少6，其中柱被分组成至少4区段(α、β、Y、δ )，其中至少一个收集区段(α ” . . α η_3)各自具有至少一个溶剂入口和用于居间级分F2. . . Fn_2的至少一个出口，以使它们各自将相应的居间组分(F2，. . .，Fn_2)洗出系统，但将较强吸附组分保留在区段α ” . . α n_3中，至少一个再循环区段(^1... βη_3)具有至少一个溶剂入口，并具有至少一个出口，其连接到后续下游再循环区段的入口，或者当后续下游再循环区段不存在时，连接到进样区段(S )中，以使它们通过所述出口将被要通过级分(F1. . . Fn_3)洗脱的较强吸附组分所污染的要在居间级分(F2...Fn_2)中洗脱的相应居间吸附组分洗到后续的下游再循环区段中，或者当后续下游再循环区段不存在时，洗到所述进样区段(δ )中，但将要通过(F1. . . Fn_3)洗脱的纯的较强吸附组分保留在对应的再循环区段(β”.. βη_3)中，强吸附组分收集区段(Y)具有至少一个溶剂入口和用于最强吸附组分的级分(F1)的出口，以使其通过所述出口与级分(F1) —起洗出，包含至少两个柱的进样区段(S)具有至少一个入口以接收最下游再循环区段(βη_3) 的出口的输出，还具有用于多组合混合物(Fd)进样的至少两个入口和用于至少两个最弱吸附级分(Flri、！g的至少两个出口，以使其将弱吸附组分在级分Fn_i、Fn中洗出系统，但将较强吸附的居间吸附组分的级分F1... Fn_2保留在区段δ内，其中区段(γ，β ；α, 5g； δ fa，δ fb ； δ f。，δ r)的功能依次实现，其中柱在至少一个分批模式位置运行，其中至少一个收集区段柱(α”.. αη_3)的出口用于收集居间级分(F2. . . Fn_3)，以及在至少连续或准连续的模式位置运行，其中至少一个再循环区段柱(β”.. βη_3)的出口与对应的后续下游再循环区段的入口流体连通，或者在后续下游再循环区段不存在时流体连通到所述进样区段中，其中所述分批模式和所述连续或准连续模式依次实现，其中在切换时间(t*)之后或之内，所述柱的位置向与溶剂总体流动方向相反的方向移动，并且其中在切换时间(t*)之后或之内来自每个收集区段(α”.. αη_3)的第一个柱移动到对应的再循环区段(β”.. βη_3) 的最后一个位置，最上游的再循环区段(P1)的第一个柱移动到强吸附组分收集区段(Y) 的最后一个位置，如果存在的话，其他再循环区段(β2... βη-3)的第一个柱移动到下一个上游收集区段(α”.. αη_4)的最后一个位置，强吸附组分收集区段(Y)的第一个柱移动到进样区段(S)的最后一个位置，进样区段(δ)的第一个柱移动成为最下游收集区段 (αη_3)的最后一个柱，其中区段分组(Y，β i ； α β 2 ；…；α η_3，δ g ； δ fa，δ fb ； δ f。，δ r)通过单个柱实现， 单个区段的功能和/或亚功能通过使连续或准连续洗脱步骤和分批洗脱步骤在一个切换时间(t*)之内交替进行而依次实现，其中在准连续洗脱步骤中，再循环区段的柱与进样区段的第一个柱(Sg)的输入流体连通， 进样区段的第一个柱(δ g)的输出与进样区段最后一个柱(δ r)的输入流体连通，而进样区段的第二居间柱(Sfb)以分批模式运行，其中将其入口用于多组分混合物(Fd)的进样，并且其中在分批洗脱步骤中，强吸附组分收集(Y)的柱、收集区段(α)的柱和进样区段第一个(δ J和第三个(δ fc)柱以分批模式运行，至少进样区段的第一个柱(δ fa)在运行时将其入口用于多组分混合物(Fd)的进样。
15.根据权利要求3的方法，其中仅使用四个色谱柱，并且其中区段(γ，β ；α, 5g； δ fa，δ fb ; δ f。，δ r)的功能和亚功能依次实现，并且所述分批模式和所述连续或准连续模式依次实现，其中在准连续洗脱步骤中，单个再循环区段的柱与进样区段第一个柱(Sg)的输入流体连通，进样区段第一个柱(Sg)的输出与进样区段最后一个柱(δ》的输入流体连通，而同时进样区段的第二居间柱(Sfb)以分批模式运行，将其入口用于多组分混合物 (Fd)的进样，而其出口用于收集级分(F4),在分批洗脱步骤中，在强吸附组分区段(Y)的柱、收集区段(α)的柱和进样区段的第一和第三居间柱(δ fa，5fc)以分批模式运行，其中将其入口中的至少一个用于多组分混合物(Fd)的进样。
全文摘要
给出了通过至少四个独立的色谱柱对多组分混合物(Fd)进行连续或准连续纯化的方法，所述混合物通过至少一种溶剂进样而通过所述色谱柱，其中所述多组分混合物(Fd)将被分离成整数n个级分(Fi)，其中n至少为5。柱被分组为至少6个区段((α1，...，αn-3，β1，...，βn-3，Y，δ)，其中每个区段((α1，...，αn-3，βi，...，βn-3，γ，δ)包括至少一个柱，前提是区段的功能可依次实现，并可仅用一个柱实现。有至少两个收集区段、至少两个再循环区段(β1，...，βn-3)，强吸附组分收集区段(γ)和进样区段(δ)。这些区段((α1，...，αn-3，βi，...，βn-3，γ，δ)的功能同步实现或依次实现，柱以至少一个分批模式位置(其中一个或至少两个收集区段(α1，...，αn-3)的柱的出口用于收集居间级分(F2，...，Fn-3))和至少连续或准连续模式位置(其中至少两个再循环区段的柱(β1，...，βn-3)的出口与对应的后续下游再循环区段的入口流体连通，或者当没有后续的下游再循环区段时，流体连通到所述进样区段中)运行。所述分批模式和所述连续或准连续模式同步完成或是依次完成，其中在切换时间(t*)之后或之内，柱的位置以与溶剂总体流动方向相反的方向移动，其中在切换时间(t*)之后或之内，每个收集区段(α1，...，αn-3)的第一个柱移动到对应的再循环区段(β1，...，βn-3)的最后一个位置，最上游再循环区段的第一个柱(β1)移动到强吸附组分收集区段(γ)的第一个位置，其他区段(β2，...，βn-3)的第一个柱移动到下一个上游收集区段(α1，...，αn-4)的最后一个位置，强吸附收组分收集区段(γ)的第一个柱移动到进样区段(δ)的最后一个位置，而进样区段(δ)的第一个柱移动成为最下游的收集区段(αn-3)的最后一个柱。
文档编号B01D15/18GK102271776SQ200980153948
公开日2011年12月7日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年1月6日
发明者托马斯·米勒-斯佩思, 拉尔斯·奥曼 申请人:克罗麦肯公司