一种低耗能的微球生物检测的微流控芯片的制作方法

本专利涉及的是一种低耗能的微球生物检测的微流控芯片及其制备方法。它可以用来检测蛋白质、核酸等生物大分子，能够广泛应用于临床检测、检验检疫、环境监测、药物筛选、微生物鉴定以及核酸和蛋白功能分析等领域。

背景技术：

微流控分析芯片是指通过微电子、微加工技术在平方厘米大小的固相介质表面构建的微型分析系统，以实现对组织和细胞中DNA、蛋白质和其他生物组分的快速、高效、灵敏的处理与分析。它是20世纪90年代初中期在分析化学领域发展起来的一种分析技术，以分析化学和分析生物化学为基础，应用微电子加工技术，在微芯片上加工出微米级的容器、泵、阀、管道等微结构网络，将样品的制备、反应和检测的这个过程进行集成的微全分析系统。芯片的大小在几个平方厘米左右，选用硅片、玻璃、硅橡胶、塑料等材料作为基片和盖片，通过蚀刻、光刻或印模等方法加工微通道，采用电、压力、重力等方式驱动通道内的流体，最后采用化学发光、电化学、荧光检测器等进行检测。该芯片在装置上的主要特征是其容纳流体的有效结构(包括其通道、反应室和其它功能部件)至少在一个维度上为微米级尺度。与宏观尺寸的实验装置相比，微流控分析芯片的微米级结构可以显著增大流体环境的面积体积的比例。这一变化在微流控系统中导致一系列与物体表面有关的决定其特殊性能的特有效应，如层流效应，表面张力及毛细效应，快速热传导效应以及扩散效应等。这些效应可以使微流体分析芯片的分析性能得到显著的改善，包括可以使分析装备的体积减小，装备更加的集成化自动化，可以显著提高分析效率以及使试样和试剂消耗显著下降等。把实验室大型设备集成在尽可能小的操作平台上，用以完成不同的实验过程，并能对产物进行分析的技术。它不仅使试剂的消耗降低,而且使实验速度提高，费用降低，充分体现了当今实验室设备微型化、集成化和便携化的发展趋势。现在微流控芯片已在生物化学分析和环境分析诸方面发有了广泛的应用和快速的发展。由于微流控芯片将整个样品分析的过程，包括取样和样品的处理、预浓集、稀释和混合、分离、化学反应和信号检测全部集成化在一块小的芯片上，它与传统的分析装置相比实现了亚微升甚至纳升级的试剂和样品消耗，反应空间的大大缩小使反应的均一性提高，反应速度加快，同时降低了生产成本并便于携带。

专利内容

技术问题：本专利的目的是提供一种低耗能的微球生物检测的微流控芯片，用于以微球为固相载体进行生物分子检测。将固定有生物探针分子的编码微球通过芯片进行进样、与待测样品反应、洗涤和检测，提供一种检测分析的芯片平台。

技术方案：本专利的目的可以通过以下技术方案实现：

本专利的基于微球生物检测的微流控芯片由位于上半部的盖片和位于下半部的基片所组成；在基片或盖片内设有功能性的微通道网络，在微通道网络中设有具有编码的微球作为生物分子检测的载体，在微通道网络中，反应池的外周是筛分管道，筛分管道的外周是辅助管道，辅助管道与出口相接，反应池通过长通道接进口。

生物分子检测以微球作为载体，微球具有编码，在微球的表面固定有生物分子探针，所用的生物分子探针可以是核酸、蛋白质、多肽中的一种。

在芯片反应池中进行微球与待测样品的反应；待测溶液和洗涤缓冲液通过进口进入反应池，在反应池中与微球反应或洗涤微球，反应结束微球被输入通道中检测并输出。

微球作为探针分子载体，其材料可以是玻璃、或聚苯乙烯和橡胶，微球的大小在50μm～300μm之间；芯片的基质材料可以是玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯聚二甲基硅氧烷及聚碳酸酯中的一种。

编码微球是条形码编码、荧光编码、量子点编码、光子晶体编码、拉曼标签编码、红外光谱编码、形状编码、射频编码、大小编码以及位置编码中的一种。

反应池的直径在200μm～1200μm之间，长通道宽度在60μm～550μm之间，长度在10mm～50mm之间。

其工作原理是：

a)在芯片出口处连接一个往返式注射泵或者蠕动泵，将芯片外编码微球连其运载缓冲液通过长通道，吸入反应池。由于筛分通道的尺寸小于编码微球的直径，因此通过泵的继续抽吸，微球留在反应池中，而运载微球的缓冲液则被吸干；

b)此时，在通过进口吸入待测样品溶液到反应池，使待测样品溶液与微球充分反应；

c)反应完毕，继续通过进口吸入洗涤缓冲液；

d)洗涤完全之后，通过出口注入微球运载缓冲液，使微球随运载缓冲液进入长通道，在微球通过长通道时，检测微球表面的反应结果。

有益效果：根据本专利，利用芯片进行检测载体、样品注样，反应，洗涤和检测的连续化操作，以编码微球为生物分子检测的固相载体具有以下优点：

(1)检测速度快：由于杂交反应只在微通道内进行，杂交液循环流动，可以减少溶液的挥发和目的靶分子到达探针的时间，提高反应的速度，缩短检测时间；

(2)可以实现多元分析检测：每次进样的微球具有编码，因此可以编码多元生物分子检测，同时检测同一个样品中的多个指标。同时球形载体具有比表面积大，可以滚动等特点，所以检测反应的灵敏度高，样品需要量少，反应速度快；

(3)准确度高：微球在进入长通道的时候，由于通道尺寸略大于微球直径，远小于两个微球的直径，因此微球只能单个通过，依次被检测，准确性高；

(4)可扩展性高：由于采用了微流控芯片的形式，可以方便的同样品预处理等微流控芯片集成，促进了分析系统的微型化和自动化；

(5)本专利同时结合了微球载体以及微流控芯片的生物检测优势，对小尺寸的微球操作简单，具有鲜明的优势。

附图说明

图1为本专利芯片的俯视图。

图2为本专利芯片使用时，整个装置的结构示意图。

以上的图中有：进口1、出口2、长通道3、反应池4、辅助管道5、筛分管道6。

具体实施方式

本专利是一种基于微球的微流控分析芯片，该生物芯片由位于上半部的盖片和位于下半部的基片所组成；在基片或盖片内设有功能性的微通道网络，在微通道网络中设有具有编码的微球作为生物分子检测的载体，在微通道网络中，反应池4的外周是筛分管道6，筛分管道6的外周是辅助管道5，辅助管道5与出口2相接，反应池4通过长通道3接进口1。

生物分子检测以微球作为载体，微球具有编码，在微球的表面固定有生物分子探针，所用的生物分子探针可以是核酸、蛋白质、多肽中的一种。在芯片反应池4中进行微球与待测样品的反应；待测溶液和洗涤缓冲液通过进口1进入反应池4，在反应池4中与微球反应或洗涤微球，反应结束微球被输入通道3中检测并输出。微球作为探针分子载体，其材料可以是玻璃、或聚苯乙烯和橡胶，微球的大小在50μm～300μm之间；芯片的基质材料可以是玻璃、硅、聚甲基丙烯酸甲酯八、聚二甲基硅氧烷及聚碳酸酯中的一种。编码微球是条形码编码、荧光编码、量子点编码、光子晶体编码、拉曼标签编码、红外光谱编码、形状编码、射频编码、大小编码以及位置编码中的一种。反应池4的直径在200μm～1200Iμm之间，长通道3宽度在60μm～550μm之间，长度在10mm～500mm之间。

作为探针分子载体的微球其材料可以是玻璃、聚苯乙烯或橡胶等。

实施例一：以PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)作为芯片材料，在光子晶体编码玻璃微球上固定探针进行生物检测，微球直径为50μm。

A.基片的制备：采用激光微加工方法。通过AutoCAD设计微通道图形，将CAD图形转换成激光微加工系统可识别指令；采用激光微加工系统在基片(或盖片)上加工成所需的网络微通道，其中，长通道宽度为60μm,长20mm，反应池直径为250μm，筛分管道宽为20μm，通道的深度为60μm。两端打孔分别作为进样口和出样口；

B.盖片的制备：选择与基片同样大小的PMMA片子作为盖片；盖片和基片的封装:直接通过玻璃态热键和方法进行基片和盖片的封装；

C、微球上固定探针：洗净的微球经硅烷化和双功能试剂修饰，然后将不同的探针分子固定到光子晶体编码的玻璃微球上；

D.微流控芯片的连接：进口1通过管线连接样品池，出口2接往复式注射泵；

E、进样：通过注射泵将编码微球连同其运载缓冲液吸入长通道3，然后进入反应池4，最后抽干运载缓冲液，编码微球留在反应池4中；

F、反应：通过注射泵将待检测溶液吸入长通道3，最后进入反应池4中与编码微球表面的探针分子进行反应；

G、洗涤：反应完毕后，通过注射泵从入口1吸入洗涤缓冲液到反应池4对微球进行充分洗涤：

H、检测：抽干反应池4中的洗涤缓冲液，利用注射泵从出口2注入微球的运载缓冲液，运载缓冲液将微球带入长通道(3)，微球依次通过长通道(3)，并在长通道3中依次被检测。

实施例三：以PDMS〔聚二甲基硅氧烷)作为芯片材料，在荧光编码玻璃微球上固定探针进行生物检测，微球直径为200μm。

a、基片的制备：选择PDMS的基质和固化剂的比例为10：1(质量比)混合均匀后，经真空抽气以除去气泡后，浇注在事先加工好的阳模上，进行加热固化25min,其中，长通道宽度为250μm，长50mm，反应池直径为1200μm，筛分管道宽为50μm，通道的深度为250μm。固化好后将PDMS从模版上揭下，即制成基片；

b、盖片的制备：选择PDMS的基质和固化剂的比例为5：1(质量比)混合均匀后，经真空抽气以除去气泡后，直接水平放置加热固化20min即制成盖片；

c、盖片和基片的封装：固化好的基片和盖片再用氧等离子体处理后贴合，然后直接通过热键合方法进行基片和盖片的封装；

d、微球上固定探针：将不同的探针分子固定到不同编码的玻璃微球表面；

e、微流控芯片的连接：进口1通过管线连接样品池，出口2接往复式微注射泵；

f、进样：通过注射泵将编码微球连同其运载缓冲液吸入长通道3，然后进入反应池4，最后抽干运载缓冲液，编码微球留在反应池4中；

g、反应：通过注射泵将待检测溶液吸入长通道3，最后进入反应池4中编码微球表面的探针分子进行反应；

h、洗涤：反应完毕后，通过注射泵从入口1吸入洗涤缓冲液到反应池4对微球进行充分洗涤；

i、检测：抽干反应池4中的洗涤缓冲液，利用注射泵从出口2注入微球的运载缓冲液,运载缓冲液将微球带入长通道3，微球依次通过长通道3，并在长通道3中依次被检测。