一种氨基寡糖功能化的杂化硅胶整体柱及制备方法与流程

本发明属于整体柱功能材料制备领域，具体涉及一种氨基寡糖功能化的杂化硅胶整体柱及制备方法。

背景技术：
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有机-无机杂化硅胶整体柱，是一类新兴的毛细管电色谱分离柱。目前，有机-无机杂化硅胶整体柱主要基于反相作用或亲水作用原理进行色谱分离。在碱性蛋白或生物碱分析中，传统杂化硅胶整体柱内壁残留含有负电荷性硅羟基，碱性化合物与管壁会发生非特异性不可逆吸附，产生严重的峰拖尾、峰展宽等不良现象。

引入碱性功能单体在线聚合或柱后修饰改性，制备具有阳离子正电荷的多作用模式功能化整体柱，有利于提高有机-无机杂化硅胶整体柱的分析应用性。现已有较多的文献报道，采用高分子化合物，如聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺和植物纤维素等，可以有效抑制毛细管柱管内壁对碱性化合物的吸附效应。糖类化合物，分子具有较强的亲水性和分子易成膜，作为固定相表面修饰试剂在功能材料制备领域备受“青睐”。在糖类改性固定相制备方面，现有文献报道主要通过物理吸附或通过管壁修饰醛基后柱后偶联羧甲基壳聚糖等化学反应，将含有羧基和氨基的羧甲基壳聚糖吸附于管壁制备开管涂层固定相。值得注意的是，目前所报道的糖类改性固定相主要基于物理凝聚或胺醛缩合反应，高分子凝聚形成的聚合物结构为无序状态；另一方面，采用毛细管内壁修饰的醛试剂与糖缩合反应，或采用不饱和烯基自由基聚合引入酰胺基团，再与壳聚糖氨基缩合反应，糖试剂在戊二醛分子或一维碳链聚合结构上偶联，形成的聚合物结构为一维聚合结构低度交联形成的二维或三维结构。构建高度交联三维结构的糖功能化杂化硅胶整体柱有待取得突破。

纳米复合材料是以聚合基体为连续相，将纳米尺寸的粒子、纤维、纳米碳管等分散相均匀性地分散于基体材料中，形成含有纳米尺寸材料的均一相复合体系。笼型聚倍半硅氧烷具有由-Si-O-交替连接的硅氧骨架组成的立体结构内核，通过活性基团与功能单体或修饰试剂发生接枝或者聚合反应，可以实现分子层上的均匀分散。引入立体笼型聚倍半硅氧烷，在八面体上键合修饰糖类功能分子，发展具有高度交联聚合结构的碱性氨基寡糖功能化的纳米复合材料，提供稳定的立体构型，实现亲水、氢键和离子交换等多重作用，将良好地满足碱性化合物的高效分离。

技术实现要素：
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本发明的目的在于提供一种氨基寡糖功能化的杂化硅胶整体柱及制备方法。本发明先以环氧基聚倍半硅氧烷与多胺试剂开环加成聚合，形成具有有序三维结构的杂化硅胶整体柱基质固定相，在此基础上，柱后衍生键合氨基寡糖制得；所述的氨基寡糖在笼型聚倍半硅氧烷立体分布的环氧基开环加成产物上缩合偶联，制备的整体柱具有聚倍半硅氧烷（-SiO_3/2）n纳米笼型结构（n=8）、碱性氨基（-NH₂）/胺基（-NH-CH₂-）基团和极性羟基（-OH）基团，固定相结构稳定、作用官能团种类多，在酸性条件下能产生稳定的正电荷和阴极电渗流，实现亲水、氢键、离子交换等多种作用模式，用于极性酚类或带电荷碱性化合物的高效分离。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种氨基寡糖功能化的杂化硅胶整体柱，所述的整体柱先以环氧基聚倍半硅氧烷与多胺试剂开环加成聚合，形成具有高度交联三维结构的杂化硅胶整体柱基质固定相，在此基础上，柱后衍生键合氨基寡糖制得；所述的整体柱固定相表面键合带正电荷阳离子的碱性氨基寡糖。

其中，所述的氨基寡糖在笼型聚倍半硅氧烷立体分布的环氧基开环加成产物上缩合偶联，所制得的整体柱具有聚倍半硅氧烷（-SiO_3/2）n笼型结构，其中n=8以及碱性氨基-NH₂/胺基-NH-CH₂-基团和极性羟基基团-OH。

按质量百分数之和为100%计，所述整体柱基质固定相中各组分占组成总质量的百分比为：环氧基聚倍半硅氧烷试剂13.40%，多胺试剂 11.60%，致孔剂由三元体系组成，其中一元醇致孔剂57.75%~58.50%，二元醇致孔剂10.50%~10.88%，醇聚合物致孔剂6.00%~6.75%。

所述的环氧基聚倍半硅氧烷试剂为八环氧基笼型倍半硅氧烷；

所述的多胺试剂为聚乙烯亚胺1200；

所述的一元醇致孔剂为正丙醇，二元醇致孔剂为1,4-丁二醇，醇聚合物致孔剂为聚乙二醇10000；

所述的氨基寡糖为高水溶性带正电荷阳离子的氨基寡糖素。

其中，所述原料氨基寡糖素为质量分数为0.30%-1.00%的氨基寡糖素溶液；所述的氨基寡糖素溶液的溶剂为0.1% 醋酸溶液。

本发明的另一目的在于提供一种制备上述的氨基寡糖功能化的杂化硅胶整体柱的方法，包括以下步骤：

（1）毛细管柱壁表面氨基化：

对毛细管空柱依次采用0.1mol/L的盐酸溶液、1.0 mol/L的NaOH溶液冲洗3小时，去离子水冲洗15分钟、甲醇冲洗15分钟，在50℃下氮气吹干；注入甲醇与氨丙基三甲氧基硅烷体积比为1∶1的混合物，在60℃下反应12小时，用甲醇冲洗15分钟；在70℃下氮气吹干，制得柱壁表面氨基化的毛细管；

（2）环氧基聚倍半硅氧烷与多胺试剂开环聚合：

按比例称取环氧基聚倍半硅氧烷试剂、多胺试剂、致孔剂，混合均匀，超声振荡15分钟，然后将混合物注入经氨基化预处理过的毛细管中，控制注入的液柱的长度为28~32厘米，两端封闭并浸于50℃水浴锅中恒温加热16小时；待反应完成后，以甲醇为流动相，在液相色谱泵上冲洗毛细管柱1小时，冲去床层内残留的溶剂、再将毛细管柱在泵压12Mpa状态下平衡10~15 h，得到以环氧基聚倍半硅氧烷与多胺试剂开环聚合的杂化硅胶整体柱基质固定相；

（3）碱性氨基低聚糖柱后修饰：

将醛溶液用液相泵通入以环氧基聚倍半硅氧烷与多胺试剂开环聚合的整体柱基质固定相，60℃恒温反应1小时；将氨基寡糖素溶液注入醛基反应后的毛细管柱内60℃恒温反应3小时，使管壁表面上醛基与寡糖分子侧链的氨基发生缩合反应；反应后用甲醇水冲洗，除去残留的醛试剂，即制备表面键合碱性氨基寡糖的杂化硅胶整体柱。

其中，步骤（3）所述的醛溶液是采用pH=8.00、浓度为50 mmol/L 磷酸盐缓冲液配制的10%戊二醛溶液。

本发明的显著优点在于：

（1）本发明所述的氨基寡糖功能化的杂化硅胶整体柱，以环氧基聚倍半硅氧烷与多胺试剂开环加成聚合，基体中纳米尺寸的笼型聚倍半硅氧烷分散相均匀分散，具有由Si-O交替连接的聚倍半硅氧烷（-SiO_3/2）n纳米构型，形成高度交联三维结构的杂化硅胶整体柱基体；在此基础上，衍生键合氨基寡糖，氨基寡糖在笼型聚倍半硅氧烷立体分布的环氧基开环加成产物上缩合偶联，实现分子层上的均匀分散，提高聚合物骨架稳定性和纳米结构效应。

（2）本发明所述的氨基寡糖功能化的杂化硅胶整体柱，以八环氧基聚倍半硅氧烷与支化聚乙烯亚胺开环加成聚合，每个八环氧基笼型聚倍半硅氧烷分子上具有八个相对独立的环氧基作用位点，与带有多个-NH₂的聚乙烯亚胺作用，每个笼型聚倍半硅氧烷分子均可立体有序地引入支化聚乙烯亚胺，形成立体有序的氨基表面功能化的有机杂化硅胶聚合固定相，可为后续偶联氨基寡糖提供立体的、高密度的氨基作用界面，提高氨基寡糖的修饰键合效率。

（3）本发明中以环氧基聚倍半硅氧烷与多胺试剂开环加成聚合形成基质固定相，在此基础上，柱后衍生键合氨基寡糖制得功能化整体柱，所制备的整体柱在笼型聚倍半硅氧烷立体构架上具有碱性氨基（-NH₂）/胺基（-NH-CH₂-）基团和极性羟基（-OH）基团，在酸性条件下能产生稳定的正电荷和阴极电渗流，避免了常规杂化硅胶柱通过吸附流动相中碱性化合物产生的静电吸附问题，并且可以比单一功能单体纳米复合整体柱提供更多的作用模式，实现亲水、氢键、离子交换等多种作用模式，适用于极性酚类或带电荷化合物的高效分离。

附图说明

图1 氨基寡糖功能化杂化硅胶整体柱分离核苷碱基；其洗脱峰依次为：0. 甲苯，1. 尿嘧啶，2. 尿苷，3. 氧氨嘧啶，4. 胞嘧啶，5. 鸟嘌呤；

图2 酚类化合物及不保留标记物分离色谱；其洗脱峰依次为：0. 甲苯，1. 苯酚，2. 对苯二酚，3. 间苯二酚，4. 间苯三酚。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

一种氨基寡糖功能化的杂化硅胶整体柱，先以环氧基聚倍半硅氧烷与多胺试剂开环加成聚合，形成具有高度交联三维结构的杂化硅胶整体柱基质固定相，在此基础上，柱后衍生键合氨基寡糖制得；所述的整体柱固定相表面键合带正电荷阳离子的碱性氨基寡糖。本实施例中按照表1所述的组分制备了A、B、C三种氨基寡糖功能化的杂化硅胶整体柱。

表1 环氧基聚倍半硅氧烷与聚乙烯亚胺开环聚合整体柱固定相的不同组分含量表

其具体制备步骤如下：

（1）毛细管柱壁氨基化：

用0.1mol/L的盐酸溶液冲洗毛细管空柱3小时，用去离子水冲洗10分钟；接着用1.0 mol/L的NaOH溶液冲洗3小时，用去离子水冲洗15分钟，接着甲醇冲洗15分钟，在50℃下氮气吹干待用；

在以上处理过的毛细管空柱中注入甲醇与氨丙基三甲氧基硅烷体积比为1∶1的混合物，在60℃下反应12小时，使毛细管壁上键合带氨基的硅烷化物质；用甲醇冲洗15分钟；在70℃下氮气吹干，得氨基硅烷化的毛细管；

（2）环氧基聚倍半硅氧烷与多胺试剂开环聚合：

将八环氧基笼型聚倍半硅氧烷、聚乙烯亚胺1200，三元致孔剂：正丙醇、1,4-丁二醇和聚乙二醇10000的质量比分别按以表1数据配制。

将组成整体柱基质固定相的各组分均匀混合，超声振荡15分钟，然后将混合物注入经氨基化预处理过的毛细管中，控制注入的液柱的长度为28~32厘米，两端封闭并浸于50℃水浴锅中恒温加热16小时；待反应完成后，以甲醇为流动相，在液相色谱泵上冲洗毛细管柱1小时，冲去床层内残留的溶剂、再将毛细管柱在泵压12Mpa状态下平衡10~15 h，得到以环氧基聚倍半硅氧烷与多胺试剂开环聚合的整体柱基质固定相。

（3）碱性氨基低聚糖柱后修饰：

应用液相泵将10%戊二醛溶液通入以环氧基聚倍半硅氧烷与多胺试剂开环聚合的整体柱基质固定相，60℃恒温反应1小时；将质量分数为0.30%-1.00%的氨基寡糖素溶液注入醛基反应后的毛细管柱内60℃恒温反应3小时，完成管壁表面上醛基与寡糖分子侧链的氨基发生缩合反应。反应后用甲醇水冲洗，除去残留试剂，即制备表面键合碱性氨基寡糖的杂化硅胶整体柱。

应用实施例1

应用以上制备的氨基寡糖键合的整体柱B，以乙腈:醋酸铵盐缓冲液（40.0 mmol/L，pH 5.60）=80:20为流动相，分离电压+3 kV，泵压力1000psi，流速0.10mL/min，对核苷碱基进行毛细管电色谱分离；如图1所述，在该整体柱提供的亲水、氢键和离子交换作用的共同作用下，核苷碱基得到了快速分离，洗脱峰依次为：0.乙腈，1. 尿嘧啶，2. 尿苷，3. 氧氨嘧啶，4. 胞嘧啶，5. 鸟嘌呤。

应用实施例2

应用以上制备的氨基寡糖键合的整体柱B，在氢键相互作用分离模式，以5.0 mmol/L pH 5.60的醋酸-醋酸铵溶液/乙腈(20:80，v/v)为流动相，运行电压+13kV，辅助压力1000psi，泵流速0.10mL/min，实现了4种酚类化合物及不保留标记物的分离如图2所示，图2中洗脱峰依次为：0：甲苯，1. 苯酚，2. 对苯二酚，3.间苯二酚, 4. 间苯三酚。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。