本发明涉及嗜硫材料，具体地，涉及一种嗜硫磁珠及其制备方法和应用。
背景技术：
二硫键的生物分子在原核和真核生物的激素、酶、免疫球蛋白、血浆、抑制剂和毒液等生命科学领域分布非常广泛，其中的大部分已成为疾病诊断的重要标志物。但是这些样品组成复杂，丰度低，检测难度大。因此，采用合适的方法对其进行富集、浓缩、纯化等前处理，对提高检测灵敏度与消除干扰具有非常重要的意义。
嗜硫色谱法是一种亲和色谱方法，嗜硫色谱介质上砜-硫醚基团在高浓度的盐存在下，可以与化合物上的二硫键发生相互作用，再低浓度盐条件下进行洗脱，对抗体纯化方面和对含二硫键化合物进行富集、浓缩与纯化。嗜硫色谱法是由porath(参见《febsletters》1985年第185期第306-310页)最早发现于1985年，其后得到迅速的发展。
目前常见的作为载体的亲和嗜硫材料为琼脂糖、凝胶等软基质材料，其存在机械强度小、无法承受高压力、制备成本高和难以存储的缺点。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种嗜硫磁珠及其制备方法和应用，该嗜硫磁珠具有优异的超顺磁性和分散性，进而使其能够对含二硫键的化合物具有优异的富集与分离效果，同时该制备方法具有工序简单和原料易得的优点。
为了实现上述目的，本发明提供了一种嗜硫磁珠的制备方法，该制备方法为：在引发剂和溶剂的存在下，将铁磁性复合材料fe3o4@sio2、磺胺类化合物(含有对氨基苯磺酰胺结构的化合物的总称)进行缩合反应制得嗜硫磁珠fe3o4@sio2@saa。
本发明还提供了一种嗜硫磁珠，该嗜硫磁珠通过上述的制备方法制备而得。
本发明进一步提供了一种如上述的嗜硫磁珠在含二硫键化合物的特异性的富集和分离中的应用。
在上述技术方案中，具体过程如图1所示(图中的r基团指的是副反应产物)，本发明通过将铁磁性复合材料fe3o4@sio2、磺胺类化合物通过氨基和羧基之间的缩合作用进行反应，进而使得磺胺类化合物修饰到铁磁性复合材料fe3o4@sio2的表面上形成表面修饰砜基的嗜硫磁珠，该嗜硫磁珠将嗜硫材料和磁珠的特性完美地结合在一起，进而该嗜硫磁能在强力磁铁石的作用下与体系中的其他组分快速分离，操作方便、快捷；此外，该磁珠具有稳定性好、比表面积高、分离速度快、低毒性、分散性好、超顺磁性、易制备以及生物相容性等优点，因此本发明提供的嗜硫磁珠具有优异的分散性、超顺磁性和富集效果，以解决常用亲和嗜硫材料存在的局限性。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明提供的嗜硫磁珠的制备原理图；
图2检测例2中嗜硫磁珠b1的傅里叶变换红外光谱图；
图3检测例3中嗜硫磁珠b1的透射电镜图；
图4是应用例1中提供的嗜硫磁珠b1对含二硫键有机小分子特异性分离与富集的电泳图；
图5是应用例2-4中提供的嗜硫磁珠b1对含二硫键有机小分子特异性分离与富集的电泳图；
图6是应用例5-7中提供的嗜硫磁珠b1对含二硫键有机小分子特异性分离与富集的电泳图；
图7是应用例8-10中提供的嗜硫磁珠b1对含二硫键有机小分子特异性分离与富集的电泳图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种嗜硫磁珠的制备方法，该制备方法为：在引发剂和溶剂的存在下，将铁磁性复合材料fe3o4@sio2、磺胺类化合物进行缩合反应制得嗜硫磁珠fe3o4@sio2@saa。
在本发明中，磺胺类化合物的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高嗜硫磁珠的产率以及从经济的角度考虑，优选地，磺胺类化合物为下式所示的saa，
在本发明中，引发剂的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高嗜硫磁珠的产率以及从经济的角度考虑，优选地，引发剂选自过硫酸盐、有机过氧化物和叔胺中的至少一者，更优选地，引发剂选自过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸钾、过氧化苯甲酰和叔胺中的的至少一者；进一步优选地，引发剂为过硫酸铵。
在上述制备方法中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高嗜硫磁珠的产率，优选地，相对于30-80mg的fe3o4@sio2，所述saa的用量为0.16-0.8mmol，所述引发剂的用量为0.2-1.2mmol；其中，溶剂的用量也可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产物的产率，更优选地，相对于40mg的fe3o4@sio2，溶剂的用量为5-20ml。
在本发明中，溶剂的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高嗜硫磁珠的产率以及从经济的角度考虑，优选地，溶剂选自乙醇、水中的至少一者。
在本发明中，缩合反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高嗜硫磁珠的产率以及从经济的角度考虑，优选地，缩合反应满足以下条件：反应温度为15-35℃，反应时间为1-5h。
在上述制备方法中，反应容器可以是本领域中常规的玻璃容器，如烧瓶、试管、反应釜、烧杯，但是为了便于震荡，选择离心管作为反应容器。
在本发明中，fe3o4@sio2可以是常规的市售品，也可以是通过自行制备而得，考虑到保证fe3o4@sio2的纯度，优选地，fe3o4@sio2通过以下方法制备而得：
1)将铁盐、1,6-己二胺、醋酸盐、乙二醇进行接触反应以制得铁磁性材料fe3o4；
2)将四乙氧基硅烷、氨水、c1-c4的醇进行接触反应，接着加入铁磁性材料fe3o4进行包覆以制得fe3o4@sio2。
在上述步骤1)中，各物料的用量也可在宽的范围内选择，但是为了进一步提高fe3o4@sio2的产率，优选地，在步骤1)中，相对于1g的铁盐，1,6-己二胺的用量为2-9g，醋酸盐的用量为0.5-4g，乙二醇的用量为10-60ml。
在上述步骤2)中，各物料的用量也可在宽的范围内选择，但是为了进一步提高fe3o4@sio2的产率，在步骤2)中，相对于0.5g的四乙氧基硅烷，氨水的用量为0.5-2ml，醇的用量为5-10ml，铁磁性材料fe3o4的用量为50-150mg。
在上述步骤1)中，接触反应的条件也可在宽的范围内选择，但是为了进一步提高fe3o4@sio2的产率，优选地，在步骤1)中，接触反应满足以下条件：反应温度为100-260℃，反应时间为3-19h。
在上述步骤2)中，接触反应的条件也可在宽的范围内选择，但是为了进一步提高fe3o4@sio2的产率，在步骤2)中，接触反应满足以下条件：反应温度为15-30℃，反应时间为10-40min。
在上述步骤2)中，包覆的条件也可在宽的范围内选择，但是为了进一步提高fe3o4@sio2的产率，在步骤2)中，包覆满足以下条件：包覆温度为15-30℃，包覆时间为1-30min。
在上述制备方法中，铁盐、醋酸盐、醇的具体种类可以在宽的范围内选择，但是为了进一步提高产物的产率，优选地，铁盐选自六水合氯化铁、硫酸铁、硝酸铁中的至少一者，醋酸盐选自无水醋酸钠、醋酸钾中的至少一者，c1-c4的醇选自乙醇、甲醇中的至少一者。
在本发明中，步骤1)中所用的反应容器可以在宽的范围内选择，但是考虑到该步骤需要耐受高温环境，由此优选聚乙烯反应釜作为反应容器。
同样地，在步骤2)中所用反应容器可以是本领域中常规的玻璃容器，如烧杯，试管，但是考虑到反应溶液体积大，由此优选烧杯作为反应容器。
在本发明中，为了进一步提高fe3o4@sio2@saa的纯度，优选地，在本发明中采用有机溶剂(如甲醇、乙醇中的一种或多种)对铁磁性复合材料fe3o4@sio2、嗜硫磁珠fe3o4@sio2@saa进行萃取或淋洗。
本发明还提供了一种嗜硫磁珠，该嗜硫磁珠通过上述的制备方法制备而得。
本发明进一步提供了一种如上述的嗜硫磁珠在含二硫键化合物的特异性的富集和分离中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下中，红外图谱参数通过傅里叶-红外光谱仪(ir-21，日本岛津公司)测得，透射电镜图参数通过透射电子显微镜(ht-770，日立公司)测得，电泳参数通过毛细管电泳仪(p/acetmmdq，美国贝克曼公司)测得。
制备例1
根据文献“liangliang,jianganghe,zhenliu,boronatefunctionalizedmagneticnanoparticlesandoff-linehyphenationwithcapillaryelectrophoresisforspecificextractionandanalysisofbiomoleculescontainingcis-diols,journalofchromatographya,1216(2009)7558–7563.”记载的方法制备而得：
1)将1.0gfecl3·6h2o、6.5g1,6-己二胺、2.0g无水醋酸钠、30.0ml乙二醇在聚乙烯釜中充分混合，在198℃下反应6h，用乙醇和超纯水先后各冲洗三次，除去未反应物，制得铁磁性材料fe3o4，烘干备用。
2)分别将1g四乙氧基硅烷、4ml氨水加入到20ml乙醇中于15℃下反应20min，再加入上述250mg铁磁性材料fe3o4，于15℃下持续搅拌6min反应；最后用乙醇冲洗三次制得磁性材料(fe3o4@sio2)，烘干备用。
实施例1
将40.0mg磁性材料fe3o4@sio2、5.0mlsaa溶液(80.00mmol/l，溶剂为水)、4.0ml过硫酸铵溶液(100.00mmol/l，溶剂为水)于离心管中制得混合溶液，25℃下缓慢震荡2h制得到嗜硫磁珠b1，用乙醇冲洗三次，烘干备用。
实施例2
将80mg磁性材料fe3o4@sio2、10mlsaa溶液(80.00mmol/l，溶剂为水)、4ml过硫酸铵溶液(100.00mmol/l，溶剂为水)于离心管中制得混合溶液，35℃下缓慢震荡5h制得到嗜硫磁珠b2，用乙醇冲洗三次，烘干备用。
实施例3
将30mg磁性材料fe3o4@sio2、2.5mlsaa溶液(80.00mmol/l，溶剂为水)、2ml过硫酸铵溶液(100.00mmol/l，溶剂为水)于离心管中制得混合溶液，15℃下缓慢震荡1h制得到嗜硫磁珠b3，用乙醇冲洗三次，烘干备用。
实施例4
按照实施例1的方法制得嗜硫磁珠b4，不同的是将4.0ml过硫酸铵溶液(100.00mmol/l，溶剂为水)换成0.4mmol叔胺。
实施例5
按照实施例1的方法制得嗜硫磁珠b5，不同的是将4.0ml过硫酸铵溶液(100.00mmol/l，溶剂为水)换成4.0ml过氧化苯甲酰溶液(100.00mmol/l，溶剂为水)。
检测例1
对嗜硫磁珠b1进行红外光谱检测，结果见图2，结合该图以及相关常识，具体分析如下：曲线b是saa的红外光谱图，峰(3262.60cm-1、3370.10cm-1、3477.67cm-1)是其氨基的特征吸收峰，峰(1316.13.cm-1、1145.79cm-1)是其砜基的特征吸收；曲线a是制备成功的嗜硫磁珠fe3o4@sio2@saa红外光谱图，图中可以明显的观察到氨基的特征吸峰(3382.97cm-1)和砜基的特征吸收峰(1031.47cm-1、1126.86cm-1、1214.68cm-1)；从而证明saa成功的修饰到磁性材料的表面制得嗜硫磁珠。
按照相同的方法对b2-b5进行检测，检测结果与b1的检测结果保持一致。
检测例2
采用透射电镜的方法对嗜硫磁珠b1的形貌进行观察，结果见图3(其中a部分是放大50000倍下的透射电镜图，b部分是放大100000倍下的透射电镜图，)，由该图可知，新型嗜硫磁珠fe3o4@sio2@saa的颗粒大小均匀，具有良好的分散性。
按照相同的方法对b2-b5进行检测，检测结果与b1的检测结果保持一致。
制备例2
1)0.1mg/ml的双(4-羟基苯基)二硫醚(2s-oh)标准溶液的制备：在25℃下，将1.0mg的2s-oh溶解于10.0ml的0.5mol/l氯化钾水溶液(含5重量％的乙腈)中制得0.1mg/ml的2s-oh标准溶液。
2)0.1mg/ml的双(4-羟基苯基)甲烷(2-oh)标准溶液的制备：在25℃下，将1.0mg的2-oh溶解于10ml的0.5mol/l氯化钾水溶液(含5重量％的乙腈)中制得0.1mg/ml的2-oh标准溶液。
3)0.1mg/ml的2s-oh和0.1mg/ml的2-oh混合溶液的制备：在25℃下，将1.0mg2s-oh和1.0mg2-oh同时溶解于10.0ml的0.5mol/l氯化钾溶液(含5重量％的乙腈)中制得2s-oh和2-oh混合溶液(2s-oh和2-oh的浓度为0.1mg/ml)。
4)0.2mg/ml的双(4-羟基苯基)二硫醚(2s-oh)标准溶液的制备：在25℃下，将2.0mg的2s-oh溶解于10.0ml的0.5mol/l氯化钾水溶液(含5重量％的乙腈)中制得0.1mg/ml的2s-oh标准溶液。
制备例3
1)上样液的制备：在25℃下，将0.7163g磷酸氢二钠和0.8160g氯化钾溶于45.0ml的蒸馏水中，再用1mol/l的柠檬酸水溶液调节至ph为6.00，然后定容至50.0ml得到上样液。
2)洗脱液的制备：在25℃下，将0.7163g磷酸氢二钠45.0ml的蒸馏水中，再用1mol/l的柠檬酸水溶液调节至ph为6.00，然后定容至50.0ml得到洗脱液。
3)毛细管电泳背景缓冲液的制备：将1.791g的磷酸氢二钠溶解在约95.0ml蒸馏水中，用1mol/l的柠檬酸水溶液调节溶液至ph为8.50，定容至100.0ml，制得毛细管电泳背景缓冲溶液。
应用例1
用嗜硫磁珠对2s-oh的富集并进行ce检测。
1)称取35.0mg的嗜硫磁珠b1于离心管中，加入0.5ml的上样液、900μl的0.2mg/ml的2s-oh标准溶液，震荡平衡20min，以便让2s-oh充分的固载在新型亲和嗜硫磁珠b1上。
2)用磁铁将嗜硫磁珠b1与溶液快速分离；
3)将500μl的上样液注入上述固载了2s-oh的嗜硫磁珠b1中，将未被固载的2s-oh冲洗，去除，重复洗涤三次，
4)将15μl的洗脱液注入含有嗜硫磁珠b1(经过步骤3)处理)的离心管中，震荡平衡10min，将嗜硫磁珠b1上固载的2s-oh洗脱，制得2s-oh富集液，备测；
5)通过毛细管电泳仪(p/acetmmdq，美国贝克曼公司)对2s-oh富集液进行电泳检测，具体的检测条件为：在内径为75.0μm的熔融石英毛细管(总长度为56.5cm，有效长度为50cm)中进行；紫外检测波长为214nm，进样量为8s×0.5psi；具体结果见图4。
图4中a曲线是缓冲溶液的电泳图(空白)，b曲线是洗脱液的电泳图(对照)，c曲线是以0.1mg/ml2-oh作为样品的电泳图，d曲线是0.1mg/ml2s-oh溶液作为样品的电泳图，e曲线是0.1mg/ml2s-oh和0.1mg/ml2-oh的混合溶液作为样品的电泳图，f曲线是第一次清洗未被固载的组分的电泳图，g曲线是第二次清洗未被固载组分的电泳图，h曲线是经材料富集后洗脱下来的组分的电泳图。
由图4可知，在相同条件下，2-oh在高浓度盐条件下无法被嗜硫磁珠特异性保留，而2s-oh能被特异性保留；加入洗脱液后，可以顺利将2s-oh被洗脱下来。结果表明：嗜硫磁珠fe3o4@sio2@saa对含二硫键的化合物具有很好的特异性富集效果。
应用例2
洗脱液采取制备例2中的方法制备，所不同的是将洗脱液中的ph改变，由ph由6.00调节为5.00，对2s-oh的富集和检测按照应用例1的方法进行，所不同的是改变洗脱液的ph，具体见图5中a曲线。
应用例3
洗脱液采取制备例2中的方法制备，所不同的是将洗脱液中的ph改变，由ph由6.00调节为7.00，对2s-oh的富集和检测按照应用例1的方法进行，所不同的是改变洗脱液的ph；具体见图5中c曲线。
应用例4
洗脱液采取制备例2中的方法制备，所不同的是将洗脱液中的ph改变，由ph由6.00调节为8.00，对2s-oh的富集和检测按照应用例1的方法进行，所不同的是改变洗脱液的ph，具体见图5中d曲线。
由图5可知，随着洗脱液的ph改变，ph为6.00时，其洗脱效果最好。
应用例5
上样液采取制备例2中的方法制备，所不同的是将上样液中的ph改变，由ph由6.00调节为5.00，对2s-oh的富集和检测按照应用例1的方法进行，所不同的是改变上样液的ph，具体见图6中a曲线。
应用例6
上样液采取制备例2中的方法制备，所不同的是将上样液中的ph改变，由ph由6.00调节为7.00，对2s-oh的富集和检测按照应用例1的方法进行，所不同的是改变上样液的ph，具体见图6中c曲线。
应用例7
上样液采取制备例2中的方法制备，所不同的是将上样液中的ph改变，由ph由6.00调节为8.00，对2s-oh的富集和检测按照应用例1的方法进行，所不同的是改变上样液的ph，具体见图6中d曲线。
由图6可知，在上样液的ph为6.00时，该材料对2s-oh的吸附效果最好。
应用例8
上样液采取制备例2中的方法制备，所不同的是将上样液中的氯化钾替换为硫酸铵，对2s-oh的富集和检测按照应用例1的方法进行，所不同的是改变上样液的盐种类，具体见图7中a曲线。
应用例9
上样液采取制备例2中的方法制备，所不同的是将上样液中的氯化钾替换为硫酸钠，对2s-oh的富集和检测按照应用例1的方法进行，所不同的是改变上样液的盐种类，具体见图7中b曲线。
应用例10
上样液采取制备例2中的方法制备，所不同的是将上样液中的氯化钾替换为氯化钠，对2s-oh的富集和检测按照应用例1的方法进行，所不同的是改变上样液的盐种类，具体见图7中c曲线。
由图7可知，改变盐种类，当盐种类为kcl时，上样效果最佳。
按照应用例1-10的方法对嗜硫磁珠b2-b5进行检测，检测结果和嗜硫磁珠b1的检测结果基本保持一致。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。