一种糖-席夫碱功能材料及其制备方法和该材料在糖肽富集中的应用

本发明涉及在基质材料表层修饰氨基与糖功能单体反应后形成糖-席夫碱功能材料，同时将该糖-席夫碱功能材料应用于糖肽富集领域，具体涉及了糖-席夫碱功能材料的制备及其从复杂的蛋白酶解混合物及复杂生物样本的酶解液中选择性富集糖肽的应用。

背景技术：

蛋白质糖基化修饰是最常见的一种蛋白质翻译后修饰，70％以上的人类蛋白质上包含有一个或者多个糖链。同时，蛋白质的糖基化修饰调控真核细胞许多重要的生物过程，包括免疫应答、细胞粘附和受体激活等。此外，糖基化蛋白质的微小变化与许多疾病相关，以及可能影响到疾病后期的治疗。因此，对糖蛋白的结构进行表征非常重要。但是，糖肽在生物样品的酶解混合物中的含量极低，加上在质谱检测在非糖肽存在的情况下的会有离子抑制作用，更加增加了糖肽的检测难度；因此，开发高效的糖肽富集材料，在质谱分析前对糖肽进行选择性富集非常重要。

目前，已有的糖肽富集材料主要有四大类，凝集素材料，肼化学材料，硼酸类材料以及亲水作用色谱材料。这些材料都有各自的优缺点，比如凝集素材料够特异性识别和结合特定糖基侧链的糖肽，然而覆盖率太低；硼酸类材料能够与糖链上所含有的顺式二羟基发生可逆的共价结合，从而实现对糖肽的完整富集，然而可能对其它含有顺式二羟基的物质如核酸结合引起非特异性富集；肼化学材料需要预先将糖肽侧链上的糖上顺式邻位羟基用强氧化剂氧化成醛基，进一步通过该醛基与酰肼的共价键结合，将糖肽从复杂的样品中分离出来，这种材料会使糖链信息完全丧失，不利于对糖蛋白/糖肽上糖链结构的解析；亲水色谱法利用糖肽上含有糖基侧链比非糖肽更亲水的特性，虽然操作简单，但是特异性不高，其糖肽富集效果容易被比较亲水的非糖肽所影响。因此，开发新型的高效的糖肽富集材料十分重要。

本发明提供了一种糖-席夫碱功能材料的制备方法以及其在糖肽富集中的应用。利用修饰有氨基的基质与糖功能单体上的醛基发生亲核加成形成席夫碱的反应，制备出糖-席夫碱功能材料。该功能材料能够通过特定的化学反应之后，实现对糖肽的选择性富集，尤其是针对于肿瘤相关的唾液酸糖肽的特异性富集。将该糖-席夫碱功能材料应用于糖肽的富集中，对糖肽具有选择性高，回收率高，抗干扰比例高等优点，对于蛋白质组学，尤其是针对糖蛋白质组学中微量糖肽的解析提供了一种优异的材料。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种糖-席夫碱功能材料并且将其应用于糖肽富集中。首先，将氨基修饰到基质材料上，然后通过基质上的氨基与糖功能单体上的醛基发生亲核加成形成席夫碱，制备出糖-席夫碱功能材料。将该糖-席夫碱功能材料应用于糖肽富集领域，能够对糖肽具有高选择性、高吸附量、和高回收率的富集，并且实现低化学计量学糖肽，尤其是唾液酸糖肽的选择性富集和分离。

本发明的采用技术方案是：

一种糖-席夫碱功能材料的制备，首先将基质材料表面修饰氨基，进一步利用基质表面的氨基和糖功能单体上的醛基发生亲核加成形成席夫碱的反应，制备出糖-席夫碱功能材料。所述糖-席夫碱功能材料的制备过程，以及具体结构如下：

其中，有机物质在表面的接枝量为1～99％。

所述糖-席夫碱功能材料的具体制备方法

(1)氨基硅氧烷与基质材料中的一种或二种以上于甲苯中反应得带有氨基基团修饰过的基质材料；基质材料与氨基硅氧烷的质量体积比为1：0.1-100，甲苯溶剂中加热至80℃-110℃回流4–48h；将得到的基质材料离心，去除上层多余液体及未反应的氨基硅氧烷，后用甲苯清洗1-10次，多次离心去除上层液体后将基质材料干燥，得到氨基修饰的基质材料干燥储存，待下一步反应；

(2)将上述得到的氨基修饰的基质材料浸入含有糖功能单体的溶液中，氨基修饰的基质材料与糖功能单体的质量比为1：0.01-100；氨基修饰的基质材料与溶剂的质量体积比为：1:1-100；溶剂为水，乙醇，甲醇，乙腈或这几种溶剂，搅拌1-48h；将得到的基质材料离心，去除上层多余液体及未反应的糖功能单体，后用溶剂清洗1-10次，多次离心去除上层液体后将基质材料干燥，得到糖-席夫碱功能材料。

所述基质材料包括无机半导体si、sio2、金属au、ag、cu、al或pt，金属氧化物cuo、al2o3、fe3o4中的一种或二种以上；所述材料的粒径为是0.1-50μm,实心无孔或者含有孔径为的孔。

所述单糖功能单体为4-甲酰基苯基-β-d-葡萄糖苷，4-甲酰基苯基-β-d-阿洛糖苷或者阿洛糖，或者是葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、乙酰葡萄糖胺、乙酰半乳糖胺、核糖、脱氧核糖中的一种或二种以上的一号位上的羟基(c1-oh)溴代之后与对羟基苯甲醛反应所形成的化合物。

将糖-席夫碱功能材料应用于糖肽富集时，具体操作采用固相萃取模式或分散固相萃取模式；

如采用固相萃取模式富集糖肽，则需将糖-席夫碱功能材料填充到固相微萃取柱中，之后将蛋白酶解液上样到该固相微萃取柱上，然后使用淋洗液去除非糖肽，最后采用洗脱溶液洗脱并富集出糖肽。

如用分散固相萃取模式富集糖肽，则需将糖-席夫碱功能材料与蛋白酶解液混合，采用洗脱溶剂孵育一段时间后，采用离心的方式先将糖-席夫碱功能材料结合的糖肽同时去除非糖肽，然后再用洗脱溶液清洗结合有糖肽的糖-席夫碱功能材料，从而分离出糖肽。

上样量为糖-席夫碱功能材料：蛋白酶解液的质量为1-1000:1，富集温度为10-80℃。糖蛋白酶解物与糖-席夫碱功能材料的质量比例为1:5-200；富集和分离的温度为5-80℃；淋洗流动相和洗脱流动相的体积分别为1-1000倍的材料体积。

淋洗液的组成如下a-d任一所示：

a.a相为水，b相为乙腈、甲醇或者两者混合溶液，体积比a/b:5/95-50/50；

b.a相为甲酸铵水溶液(ph3-6)，b相为乙腈、甲醇或者两者混合溶液，体积比a/b:5/95-50/50；

c.a相为甲酸水溶液(ph2-4)，b相为乙腈、甲醇或者两者混合溶液，体积比a/b:5/95-50/50，体积比a/b:5/95-50/50；

d.a相乙酸水溶液(ph2-4)，b相为乙腈、甲醇或者两者混合溶液，体积比a/b:5/95-50/50，体积比a/b:5/95-50/50；

其中缓冲盐溶液浓度1-200mm。

洗脱液的溶剂组成如下1)-5)任一所示：

1).a相为水，b相为乙腈、甲醇或者两者混合溶液，体积比a/b:40/60-100/0；

2).a相为氨水的水溶液(ph8-11)，b相为乙腈、甲醇或者两者混合溶液，体积比a/b:40/60-100/0；

3).a相为碳酸氢铵水溶液(ph7-9)，b相为乙腈、甲醇或者两者混合溶液，体积比a/b:40/60-100/0；

4).a相为乙酸铵水溶液(ph5-7)，b相为乙腈、甲醇或者两者混合溶液，体积比a/b:40/60-100/0；

5).a相为磷酸氢钾水溶液(ph8-10)，b相为乙腈、甲醇或者两者混合溶液，体积比a/b:40/60-100/0；

其中缓冲盐溶液浓度1-500mm。

本发明具有如下优点：

1.本发明制备的糖-席夫碱功能材料制备简单，成本低，可扩展性强。

2.本发明制备的糖-席夫碱功能材料对糖肽富集具有很好的集效果。对糖肽具有选择性高，回收率高，抗干扰比例高等优点。

3.本发明制备的糖-席夫碱功能材料既可以方便的装填成不同长度，不同内径的柱子，又可以直接添加到离心管，操作简单，易于重复。特别适合复杂生物样品中微量的糖肽的分离富集；

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1.裸硅球，氨基硅球以及葡萄糖-席夫碱硅球的热重曲线。

图2.采用葡萄糖-席夫碱硅球材料从牛胎球蛋白和牛血清蛋白以1:200的摩尔比例的酶解液中富集出来的糖肽质谱图。糖肽标记有五角星或其聚糖结构：■：n-乙酰基葡萄糖胺；●：甘露糖；半乳糖；◆：唾液酸。

图3.采用葡萄糖-席夫碱硅球材料从牛胎球蛋白和牛血清蛋白以1:5000的摩尔比例的酶解液中富集出来的糖肽质谱图。糖肽标记有五角星或其聚糖结构：■：n-乙酰基葡萄糖胺；●：甘露糖；半乳糖；◆：唾液酸。

图4.葡萄糖-席夫碱硅球材料对唾液酸糖肽的吸附容量。

具体实施方式

为使本发明的内容、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例和附图进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而本发明不仅限于以下实施例。

实施例1

糖-席夫碱功能材料的制备

将1ml3-氨丙基三甲氧基硅烷加入含有5g裸硅球的甲苯(20ml)溶液，100℃甲苯回流6h。反应后，7000r/min离心5分钟，将硅球分离出来，然后加入干净的甲苯清洗2-3次，后再加入乙醇，最后离心将硅球分离出来真空干燥，得到的就是氨基修饰的硅球。

将上述氨基硅球2g加入到含有0.2g4-甲酰基苯基-β-d-葡萄糖苷的乙醇溶液(10ml)中，同时加入200μl的三乙胺溶液，常温搅拌12h。之后离心去除多余未反应的物质，再用干净的乙醇清洗反应完的硅球2-3次，之后离心将硅球分离出来真空干燥得到的就是糖-席夫碱功能材料(葡萄糖-席夫碱硅球)。热重数据如图1所示。

实施例2

将实施例1中的4-甲酰基苯基-β-d-葡萄糖苷换成4-甲酰基苯基-β-d-阿洛糖苷，其它步骤相同，则得到也是糖-席夫碱功能材料(阿洛糖-席夫碱硅球)

实施例3

糖-席夫碱功能材料在糖肽富集中的应用

以葡萄糖-席夫碱硅球为富集材料，在微尺度固相萃取模式下对糖肽进行富集。将不同摩尔比(1:200、1:5000)的牛胎球蛋白和牛血清蛋白的胰酶消化液分别加载到微尺度固相萃取柱上。随后用85％ch3cn/1％fa(ph＝2.15)和80％ch3cn/1％fa(ph＝2.15)冲洗微尺度固相萃取柱，将非糖肽冲洗掉，然后用10％nh3·h2o溶液将目标糖肽洗脱下来。采用纳米电喷雾电离-四极飞行时间质谱仪对富集出来的肽段进行了分析，结果如图2和3所示。该结果表明以葡萄糖-席夫碱@sio2为富集材料对糖肽有很好的富集效果，尤其是针对唾液酸糖肽。

实施例4

调整富集材料为阿洛糖-席夫碱硅球,其他条件同实施例3，进行选择性富集和质谱分析。

实施例5

糖-席夫碱功能材料在对唾液酸糖肽吸附容量的测定

为了测定葡萄糖-席夫碱硅球材料对糖肽的吸附容量。将1mg的唾液酸糖肽标准物质，采用80％ch3cn/20mmnh4fa(ph3.8)溶液溶解之后，逐次上样20μl到装载有1mg葡萄糖-席夫碱硅球材料制备的微型柱子中。每上样20μl之后，从柱子流出的液体都被收集，并用质谱仪分析检测。当上样的糖肽超过了材料的吸附容量时，则会在材料洗脱的溶液中检测出糖肽的信号，如图4所示，葡萄糖-席夫碱硅球材料对糖肽的富集容量高达120mg·g^-1。

实施例6

调整富集材料为阿洛糖-席夫碱硅球,其他条件同实施例5，进行富集容量的测定。阿洛糖-席夫碱硅球材料对糖肽的富集容量高达100mg·g^-1。