一种生物芯片、其制备方法、其应用及试剂盒与流程

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种生物芯片、其制备方法、其应用及试剂盒。

背景技术：

恶性肿瘤是威胁人类生命安全的主要疾病之一，它的威胁在于对其早期检测的可靠性和普及性的不足，在很多情况下当发现明显症状的时候肿瘤已经发展至恶性阶段，这个问题大大提升了肿瘤的危害性。因此，对肿瘤早期检测技术进行研究，提高其可靠性，便利性，可操作性具有重大意义。

同样，2019-ncov等流行性病毒也会威胁人类的生命健康，因此，对于2019-ncov等流行性病毒的抗体和核酸等检测技术的研究，也具有重大意义。

其中，血液中肿瘤标记物的浓度是肿瘤早期检测中重要的指标，在肿瘤早期就会出现变化，一种肿瘤通常对应着不止一种标记物，选择多种标记物进行检测则可以大大提高检测结果的准确度。目前，比较普及的基于肿瘤标记物进行肿瘤早期检测的方法主要有联酶免疫法，免疫荧光法和化学发光法，这些方法虽然已经进入实用阶段，但是仍然有各自的问题。联酶免疫法操作步骤繁琐，检测流程长，对环境要求较高，限制了它的便利性；免疫荧光法以荧光染料作为荧光探针，荧光染料虽然有着较长的应用历史，但是它的发光性能会随发光时间逐渐下降，而且在检测生物样本时，荧光染料的激发光同样会被一些生物分子吸收，产生背景荧光，这两个缺陷限制了这种检测方法的样品的可保存性和检测精确度；而化学发光法则有着选择性不够高的缺点，出现假阳性的风险较大。这些方法对操作，设备，环境的高要求无一例外限制了肿瘤早期检测便利性和普及性。

技术实现要素：

本发明实施例的目的在于提供一种生物芯片，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种生物芯片，包括：

刚性或柔性的基底；

双带隙光子晶体薄膜；所述双带隙光子晶体薄膜设置在所述基底上；所述双带隙光子晶体薄膜为聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)材质；

荧光薄膜；所述荧光薄膜设置在所述双带隙光子晶体薄膜上；所述荧光薄膜为上转换荧光纳米颗粒材质；

聚多巴胺薄膜；所述聚多巴胺薄膜设置在所述荧光薄膜上。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的生物芯片的制备方法，其包括以下步骤：

取一基底，将基底置于粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液中，并置于20～60℃的温度下进行处理后，再取出基底置于100～180℃的温度下进行烘干加固，得到附有第一光子晶体薄膜的基底；

取另一基底，将基底置于粒径为380nm～480nm的pmma纳米球溶液中，并置于20～60℃的温度下进行处理后，再取出基底置于100～180℃的温度下进行烘干加固，得到附有第二光子晶体薄膜的基底；接着，用去离子水对附有第二光子晶体薄膜的基底进行薄膜剥离，得到第二光子晶体薄膜；

将第二光子晶体薄膜覆盖在附有第一光子晶体薄膜的基底上，形成双带隙光子晶体薄膜，得到附有双带隙光子晶体薄膜的基底；

将附有双带隙光子晶体薄膜的基底置于上转换荧光纳米颗粒分散液中，并置于30～50℃的温度下进行处理，以在双带隙光子晶体薄膜上形成荧光薄膜，得到附有荧光薄膜的基底；

将附有荧光薄膜的基底置于含有多巴胺且ph为7.5～9.0的缓冲液中进行反应，以在荧光薄膜上形成聚多巴胺薄膜，得到所述生物芯片。

作为本发明实施例的一种优选方案，所述第一光子晶体薄膜的带隙位置为500nm～580nm；所述第二光子晶体薄膜的带隙位置为800nm～1000nm。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液的制备方法包括以下步骤：

将甲基丙烯酸甲酯用浓度为3～15mg/ml的氢氧化钠水溶液进行清洗，得到清洗后的甲基丙烯酸甲酯；

将清洗后的甲基丙烯酸甲酯、去离子水以及的过硫酸钾置于70～100℃的温度下进行反应，得到所述粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液；其中，清洗后的甲基丙烯酸甲酯与过硫酸钾的体积质量比以ml/mg计为(5～10):(30～40)。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述粒径为380nm～480nm的pmma纳米球溶液的制备方法包括以下步骤：

将清洗后的甲基丙烯酸甲酯、的偶氮二异丁腈、去离子水以及所述粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液，置于70～100℃的温度下进行反应，得到所述粒径为380nm～480nm的pmma纳米球溶液；其中，清洗后的甲基丙烯酸甲酯与粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液的体积比为(5～7):(30～50)；清洗后的甲基丙烯酸甲酯与偶氮二异丁腈的体积质量比以ml/mg计为(5～7):(30～40)。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述上转换荧光纳米颗粒分散液的制备方法包括以下步骤：

将的氯化钇、三氯化镱、氯化铒、十八烯以及油酸置于120～180℃的温度下进行搅拌后，再与氟化铵、氢氧化钠置于280～320℃的温度下进行反应，然后经离心分离，得到第一固体；其中，氯化钇、三氯化镱和氯化铒的摩尔比为(0.7～0.9):(0.15～0.25):(0.01～0.03)；

将的氯化钇、三氯化镱、三氯化钕、十八烯以及油酸置于120～180℃的温度下进行搅拌后，再与氟化铵、氢氧化钠、上述第一固体置于270～340℃的温度下进行反应，然后经离心分离，得到第二固体；其中，氯化钇、三氯化镱和三氯化钕的摩尔比为(0.6～0.8):(0.1～0.2):(0.1～0.3)；

将上述第二固体分散于环己烷中，得到所述上转换荧光纳米颗粒分散液。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述制备方法制得的生物芯片。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的生物芯片在制备用于检测肿瘤标记物和/或病毒的试剂盒中的应用。

其中，肿瘤标记物包括前列腺特异抗原(psa)等，但不限于此；病毒包括2019-ncov等流行性病毒的核酸或抗体等，但不限于此；另外，该生物芯片也可以用于检测其他抗原、抗体或蛋白质，并不限于肿瘤标记物和病毒的检测。

本发明实施例的另一目的在于提供一种试剂盒，所述试剂盒用于检测肿瘤标记物和/或病毒，其包括上述的生物芯片。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述试剂盒还包括金纳米粒子。

本发明实施例提供的一种生物芯片，利用双带隙pmma蛋白石光子晶体结构增强的上转换荧光薄膜，可以配合荧光共振能量转移检测法来检测psa等肿瘤标记物。其中，本发明实施例通过选择核壳结构上转换荧光纳米颗粒nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,nd³⁺作为荧光探针，可以有效地避免光漂白，背景荧光以及高能量紫外光伤害生物分子的问题，以提高上转换发光量子效率。另外，本发明实施例通过设计一种新型纳米结构，同时使用两种pmma蛋白石光子晶体，它们的带隙位置分别为800～1000nm和500～580nm之间，分别与nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,nd³⁺的激发光波长和发射光波长对应，将两种光子晶体做成双层结构，将nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,nd³⁺粒子通过自组装沉降到光子晶体表面形成荧光薄膜，这种双层结构可以同时对nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,nd³⁺的上转换发光的激发光和发射光进行增强，比起普通的光子晶体进一步提升上转换发射光强度，nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,nd³⁺纳米粒子表面的油酸配体可以有效地增强光子晶体的水稳定性，在增强了上转换荧光的基础上，将荧光颗粒作为能量给体，在荧光薄膜表面修饰聚多巴胺薄膜用于连接psa等捕获抗体，另外，使用吸收峰为545nm左右的金纳米粒子作为能量受体并修饰psa等检测抗体，利用抗体-抗原-抗体连接将金纳米粒子与荧光颗粒间的距离拉近，使荧光共振能量转移效应发生，通过观察荧光强度减弱来确定样品中的psa等待检测物质的浓度。这种检测方法具有很好的稳定性和便利性。除此之外，这种方法可以应用于各种利用特异性结合的检测方式，如抗体-抗原结合、抗体-抗原-抗体结合、核酸的特异性结合等，这意味着这种检测方法有着广泛的应用前景，除了检测肿瘤标志物外，也可以用于各类病毒如2019-ncov的核酸、抗体等检测。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的生物芯片的结构示意图。图中，1-基底、2-第一光子晶体薄膜、3-第二光子晶体薄膜、4-荧光薄膜、5-聚多巴胺薄膜、6-捕获抗体。

图2为本发明实施例1提供的生物芯片在使用时的示意图。图中，7-待测物、8-检测抗体、9-金纳米粒子。

图3为本发明实施例1得到的双带隙光子晶体薄膜的扫描电镜图。

图4为两种单层光子晶体以及双带隙光子晶体薄膜的透射光谱图。

图5为本发明实施例1得到的上转换荧光纳米颗粒的透射电镜图。

图6为本发明实施例1得到的荧光薄膜的结构示意图。

图7～8为分别在玻璃基底、两种单层光子晶体以及双带隙光子晶体薄膜表面制备自组装的荧光薄膜的发射光谱图。

图9为本发明实施例1得到的聚多巴胺薄膜的的结构示意图。

图10为本发明实施例1得到的金纳米粒子的透射电镜图。

图11为修饰检测抗体后金纳米粒子的吸收光谱图。

图12～13为对不同浓度的psa进行检测的荧光强度对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

如附图1所示，该实施例提供了一种生物芯片，包括刚性或柔性的基底1、双带隙光子晶体薄膜、荧光薄膜4和聚多巴胺薄膜5；其中，所述双带隙光子晶体薄膜包括第一光子晶体薄膜2和第二光子晶体薄膜3，第一光子晶体薄膜2和第二光子晶体薄膜3依次设置在所述基底1上；第一光子晶体薄膜2和第二光子晶体薄膜3为聚甲基丙烯酸甲酯材质；另外，所述荧光薄膜4设置在第二光子晶体薄膜3上，荧光薄膜为上转换荧光纳米颗粒材质；所述聚多巴胺薄膜5设置在所述荧光薄膜4上。当需要检测抗原时，可以在荧光薄膜4上设置捕获抗体6；譬如，当需要检测psa时，捕获抗体6可以选用psa捕获抗体，但不限于此。

具体的，上述生物芯片的制备方法，包括以下步骤：

s1、将25ml的甲基丙烯酸甲酯用150ml浓度为10mg/ml的氢氧化钠水溶液进行清洗7次，得到清洗后的甲基丙烯酸甲酯；接着，将6ml清洗后的甲基丙烯酸甲酯、80ml的去离子水以及36mg的过硫酸钾添加至三口烧瓶中后，再置于90℃的油浴锅中进行搅拌反应90min，同时使用冷凝管进行冷凝回流，即可制得粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液，备用；另外，将6ml清洗后的甲基丙烯酸甲酯、36mg的偶氮二异丁腈、40ml去离子水以及40ml上述粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液添加至三口烧瓶中后，再置于90℃的油浴锅中进行搅拌反应90min，同时使用冷凝管进行冷凝回流，即可得到粒径为380nm～480nm的pmma纳米球溶液。

s2、取一载玻片作为基底，接着，在100ml烧杯中加入60ml去离子水以及3ml上述粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液，并进行搅拌均匀；然后，将该基底垂直插入到烧杯中，使得基底与粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液接触，并置于32℃的温度下保持处理24h后，再取出基底置于120℃的温度下进行烘干加固1h，形成带隙位置为545nm的第一光子晶体薄膜，得到附有第一光子晶体薄膜的基底。

s3、取另一载玻片作为基底，接着，在100ml烧杯中加入60ml去离子水以及3ml上述粒径为380nm～480nm的pmma纳米球溶液，并进行搅拌均匀；然后，将该基底置于烧杯中，使其与粒径为380nm～480nm的pmma纳米球溶液进行接触，并置于32℃的温度下保持处理24h后，再取出基底置于120℃的温度下进行烘干加固1h，形成带隙位置为808nm的第二光子晶体薄膜，得到附有第二光子晶体薄膜的基底。

s4、将上述附有第二光子晶体薄膜的基底垂直固定在烧杯中，接着，使用微量液体注射泵向烧杯中注射去离子水，调整注射速率，使烧杯中去离子水液面以每小时1mm的速率上升，即可将第二光子晶体薄膜从基底的表面剥离出来，并使得第二光子晶体薄膜漂浮在去离子水表面，此时，便可用另一片附有第一光子晶体薄膜的基底将第二光子晶体薄膜捞出，使得去离子水中漂浮的第二光子晶体薄膜覆盖在基底的第一光子晶体薄膜上，形成双带隙光子晶体薄膜，得到附有双带隙光子晶体薄膜的基底。

s5、将0.78mmol的六水合氯化钇、0.2mmol的六水合三氯化镱、0.02mmol的六水合氯化铒、15ml十八烯以及6ml油酸置于100ml三颈烧瓶中，并置于氮气保护气氛下，使用加热套加热至140℃进行搅拌至固体完全溶解后降温至35℃；接着，将0.148g氟化铵和0.1g氢氧化钠溶于7ml的甲醇中，得到甲醇溶液；然后，将上述甲醇溶液滴加入上述三颈烧瓶中，搅拌30min后升温至120℃去除甲醇，之后将加热套温度升至310℃加热90min后降温至35℃，这个过程加冷凝管冷凝回流，得到反应物；再接着，在反应物中加入50ml乙醇，使用离心机以9500rpm离心15min，将离心后得到的固体分散在10ml环己烷后，再加入30ml乙醇再次以9500rpm离心15min，离心得到第一固体，记为nayf4:yb³⁺,er³⁺，并将其分散在5ml环己烷中待用。

s6、将0.7mmol的六水合氯化钇、0.15mmol的六水合三氯化镱、0.15mmol的六水合三氯化钕、15ml十八烯以及6ml油酸置于100ml三颈烧瓶中，并置于氮气保护气氛下，使用加热套加热至140℃进行搅拌至固体完全溶解后降温至35℃，再将上述得到的第一固体添加至三颈烧瓶中；接着，将0.148g氟化铵和0.1g氢氧化钠溶于7ml的甲醇中，得到甲醇溶液；然后，将上述甲醇溶液滴加入上述三颈烧瓶中，搅拌30min后升温至120℃去除甲醇，之后将加热套温度升至310℃加热90min后降温至35℃，这个过程加冷凝管冷凝回流，得到反应物；再接着，在反应物中加入50ml乙醇，使用离心机以9500rpm离心15min，将离心后得到的固体分散在10ml环己烷后，再加入30ml乙醇再次以9500rpm离心15min，离心得到第二固体，即为上转换荧光纳米颗粒，可记为nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,nd³⁺，并将上述第二固体分散于5ml环己烷中，得到上转换荧光纳米颗粒分散液，待用。

s7、取1ml上述得到的上转换荧光纳米颗粒分散液和60ml的环己烷置于100ml烧杯进行混匀；接着，将上述得到的附有双带隙光子晶体薄膜的基底垂直插入到该烧杯中，使其与上转换荧光纳米颗粒分散液进行接触，并置于30℃的温度下保持处理12h，以在双带隙光子晶体薄膜上自组装形成荧光薄膜，得到附有荧光薄膜的基底。

s8、将上述附有荧光薄膜的基底垂直插入含有0.2mg/ml多巴胺且ph为8的缓冲液中进行反应2h，使多巴胺在荧光薄膜表面主动聚合，以在荧光薄膜上形成聚多巴胺薄膜，即可得到上述生物芯片。其中，缓冲液可以为市售的磷酸盐缓冲液。

另外，该实施例还提供了一种用于检测肿瘤标记物和/或病毒的试剂盒，其包括上述的生物芯片以及金纳米粒子。其中，金纳米粒子的制备方法如下：

在三颈烧瓶中加入50ml浓度为1mm氯金酸溶液，在油浴环境下搅拌加热至沸腾，沸腾后向该溶液中快速加入5ml浓度为39mm的柠檬酸钠溶液，在这个过程中，加冷凝管进行冷凝回流，溶液逐渐变为酒红色，继续加热15分钟，然后，移除热源并持续搅拌直至室温，即得到含有金纳米粒子的水溶液，避光置于4℃保存。

实施例2

该实施例提供了一种生物芯片，其制备方法包括以下步骤：

s1、将20ml的甲基丙烯酸甲酯用100ml浓度为3mg/ml的氢氧化钠水溶液进行清洗6次，得到清洗后的甲基丙烯酸甲酯；接着，将5ml清洗后的甲基丙烯酸甲酯、80ml的去离子水以及30mg的过硫酸钾添加至三口烧瓶中后，再置于70℃的油浴锅中进行搅拌反应，同时使用冷凝管进行冷凝回流，即可制得粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液，备用；另外，将5ml清洗后的甲基丙烯酸甲酯、30mg的偶氮二异丁腈、30ml去离子水以及30ml上述粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液添加至三口烧瓶中后，再置于70℃的油浴锅中进行搅拌反应，同时使用冷凝管进行冷凝回流，即可得到粒径为380nm～480nm的pmma纳米球溶液。

s2、取一载玻片作为基底，接着，在100ml烧杯中加入60ml去离子水以及3ml上述粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液，并进行搅拌均匀；然后，将该基底垂直插入到烧杯中，使得基底与粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液接触，并置于20℃的温度下保持处理32h后，再取出基底置于100℃的温度下进行烘干加固，形成带隙位置为500nm的第一光子晶体薄膜，得到附有第一光子晶体薄膜的基底。

s3、取另一载玻片作为基底，接着，在100ml烧杯中加入60ml去离子水以及3ml上述粒径为380nm～480nm的pmma纳米球溶液，并进行搅拌均匀；然后，将该基底置于烧杯中，使其与粒径为380nm～480nm的pmma纳米球溶液进行接触，并置于20℃的温度下保持处理32h后，再取出基底置于100℃的温度下进行烘干加固，形成带隙位置为800nm的第二光子晶体薄膜，得到附有第二光子晶体薄膜的基底。

s4、将上述附有第二光子晶体薄膜的基底垂直固定在烧杯中，接着，使用微量液体注射泵向烧杯中注射去离子水，调整注射速率，使烧杯中去离子水液面以每小时1mm的速率上升，即可将第二光子晶体薄膜从基底的表面剥离出来，并使得第二光子晶体薄膜漂浮在去离子水表面，此时，便可用另一片附有第一光子晶体薄膜的基底将第二光子晶体薄膜捞出，使得去离子水中漂浮的第二光子晶体薄膜覆盖在基底的第一光子晶体薄膜上，形成双带隙光子晶体薄膜，得到附有双带隙光子晶体薄膜的基底。

s5、将0.7mmol的六水合氯化钇、0.15mmol的六水合三氯化镱、0.01mmol的六水合氯化铒、15ml十八烯以及5ml油酸置于100ml三颈烧瓶中，并置于氮气保护气氛下，使用加热套加热至120℃进行搅拌至固体完全溶解后降温至35℃；接着，将0.148g氟化铵和0.1g氢氧化钠溶于7ml的甲醇中，得到甲醇溶液；然后，将上述甲醇溶液滴加入上述三颈烧瓶中，搅拌30min后升温至120℃去除甲醇，之后将加热套温度升至270℃加热90min后降温至35℃，这个过程加冷凝管冷凝回流，得到反应物；再接着，在反应物中加入50ml乙醇，使用离心机以9500rpm离心15min，将离心后得到的固体分散在10ml环己烷后，再加入30ml乙醇再次以9500rpm离心15min，离心得到第一固体，记为nayf4:yb³⁺,er³⁺，并将其分散在5ml环己烷中待用。

s6、将0.6mmol的六水合氯化钇、0.1mmol的六水合三氯化镱、0.1mmol的六水合三氯化钕、15ml十八烯以及5ml油酸置于100ml三颈烧瓶中，并置于氮气保护气氛下，使用加热套加热至120℃进行搅拌至固体完全溶解后降温至35℃，再将上述得到的第一固体添加至三颈烧瓶中；接着，将0.148g氟化铵和0.1g氢氧化钠溶于7ml的甲醇中，得到甲醇溶液；然后，将上述甲醇溶液滴加入上述三颈烧瓶中，搅拌30min后升温至120℃去除甲醇，之后将加热套温度升至270℃加热90min后降温至35℃，这个过程加冷凝管冷凝回流，得到反应物；再接着，在反应物中加入50ml乙醇，使用离心机以9500rpm离心15min，将离心后得到的固体分散在10ml环己烷后，再加入30ml乙醇再次以9500rpm离心15min，离心得到第二固体，记为nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,nd³⁺，并将上述第二固体分散于5ml环己烷中，得到上转换荧光纳米颗粒分散液，待用。

s7、取1ml上述得到的上转换荧光纳米颗粒分散液和60ml的环己烷置于100ml烧杯进行混匀；接着，将上述得到的附有双带隙光子晶体薄膜的基底垂直插入到该烧杯中，使其与上转换荧光纳米颗粒分散液进行接触，并置于30℃的温度下保持处理20h，以在双带隙光子晶体薄膜上自组装形成荧光薄膜，得到附有荧光薄膜的基底。

s8、将上述附有荧光薄膜的基底垂直插入含有0.1mg/ml多巴胺且ph为7.5的缓冲液中进行反应2h，使多巴胺在荧光薄膜表面主动聚合，以在荧光薄膜上形成聚多巴胺薄膜，即可得到上述生物芯片。其中，缓冲液可以为市售的磷酸盐缓冲液。

另外，该实施例还提供了一种用于检测肿瘤标记物和/或病毒的试剂盒，其包括上述的生物芯片以及金纳米粒子。其中，金纳米粒子的制备方法如下：

在三颈烧瓶中加入50ml浓度为1mm氯金酸溶液，在油浴环境下搅拌加热至沸腾，沸腾后向该溶液中快速加入5ml浓度为39mm的柠檬酸钠溶液，在这个过程中，加冷凝管进行冷凝回流，溶液逐渐变为酒红色，继续加热15分钟，然后，移除热源并持续搅拌直至室温，即得到含有金纳米粒子的水溶液，避光置于4℃保存。

实施例3

该实施例提供了一种生物芯片，其制备方法包括以下步骤：

s1、将30ml的甲基丙烯酸甲酯用200ml浓度为15mg/ml的氢氧化钠水溶液进行清洗8次，得到清洗后的甲基丙烯酸甲酯；接着，将10ml清洗后的甲基丙烯酸甲酯、100ml的去离子水以及40mg的过硫酸钾添加至三口烧瓶中后，再置于100℃的油浴锅中进行搅拌反应，同时使用冷凝管进行冷凝回流，即可制得粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液，备用；另外，将7ml清洗后的甲基丙烯酸甲酯、40mg的偶氮二异丁腈、50ml去离子水以及50ml上述粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液添加至三口烧瓶中后，再置于100℃的油浴锅中进行搅拌反应，同时使用冷凝管进行冷凝回流，即可得到粒径为380nm～480nm的pmma纳米球溶液。

s2、取经过紫外臭氧处理的聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)柔性薄膜固定于载玻片，作为基底，接着，在100ml烧杯中加入60ml去离子水以及3ml上述粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液，并进行搅拌均匀；然后，将该基底垂直插入到烧杯中，使得基底与粒径为240nm～280nm的pmma纳米球溶液接触，并置于60℃的温度下保持处理18h后，再取出基底置于180℃的温度下进行烘干加固，形成带隙位置为580nm的第一光子晶体薄膜，得到附有第一光子晶体薄膜的基底。

s3、取另一载玻片作为基底，接着，在100ml烧杯中加入60ml去离子水以及3ml上述粒径为380nm～480nm的pmma纳米球溶液，并进行搅拌均匀；然后，将该基底置于烧杯中，使其与粒径为380nm～480nm的pmma纳米球溶液进行接触，并置于60℃的温度下保持处理18h后，再取出基底置于180℃的温度下进行烘干加固，形成带隙位置为1000nm的第二光子晶体薄膜，得到附有第二光子晶体薄膜的基底。

s4、将上述附有第二光子晶体薄膜的基底垂直固定在烧杯中，接着，使用微量液体注射泵向烧杯中注射去离子水，调整注射速率，使烧杯中去离子水液面以每小时1mm的速率上升，即可将第二光子晶体薄膜从基底的表面剥离出来，并使得第二光子晶体薄膜漂浮在去离子水表面，此时，便可用另一片附有第一光子晶体薄膜的基底将第二光子晶体薄膜捞出，使得去离子水中漂浮的第二光子晶体薄膜覆盖在基底的第一光子晶体薄膜上，形成双带隙光子晶体薄膜，得到附有双带隙光子晶体薄膜的柔性基底。

s5、将0.9mmol的六水合氯化钇、0.25mmol的六水合三氯化镱、0.03mmol的六水合氯化铒、20ml十八烯以及10ml油酸置于100ml三颈烧瓶中，并置于氮气保护气氛下，使用加热套加热至170℃进行搅拌至固体完全溶解后降温至35℃；接着，将0.148g氟化铵和0.1g氢氧化钠溶于7ml的甲醇中，得到甲醇溶液；然后，将上述甲醇溶液滴加入上述三颈烧瓶中，搅拌30min后升温至120℃去除甲醇，之后将加热套温度升至340℃加热90min后降温至35℃，这个过程加冷凝管冷凝回流，得到反应物；再接着，在反应物中加入50ml乙醇，使用离心机以9500rpm离心15min，将离心后得到的固体分散在10ml环己烷后，再加入30ml乙醇再次以9500rpm离心15min，离心得到第一固体，记为nayf4:yb³⁺,er³⁺，并将其分散在5ml环己烷中待用。

s6、将0.8mmol的六水合氯化钇、0.2mmol的六水合三氯化镱、0.2mmol的六水合三氯化钕、20ml十八烯以及10ml油酸置于100ml三颈烧瓶中，并置于氮气保护气氛下，使用加热套加热至170℃进行搅拌至固体完全溶解后降温至35℃，再将上述得到的第一固体添加至三颈烧瓶中；接着，将0.148g氟化铵和0.1g氢氧化钠溶于7ml的甲醇中，得到甲醇溶液；然后，将上述甲醇溶液滴加入上述三颈烧瓶中，搅拌30min后升温至120℃去除甲醇，之后将加热套温度升至340℃加热90min后降温至35℃，这个过程加冷凝管冷凝回流，得到反应物；再接着，在反应物中加入50ml乙醇，使用离心机以9500rpm离心15min，将离心后得到的固体分散在10ml环己烷后，再加入30ml乙醇再次以9500rpm离心15min，离心得到第二固体，记为nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,nd³⁺，并将上述第二固体分散于5ml环己烷中，得到上转换荧光纳米颗粒分散液，待用。

s7、取1ml上述得到的上转换荧光纳米颗粒分散液和60ml的环己烷置于100ml烧杯进行混匀；接着，将上述得到的附有双带隙光子晶体薄膜的基底垂直插入到该烧杯中，使其与上转换荧光纳米颗粒分散液进行接触，并置于50℃的温度下保持处理8h，以在双带隙光子晶体薄膜上自组装形成荧光薄膜，得到附有荧光薄膜的柔性基底。

s8、将上述附有荧光薄膜的基底垂直插入含有0.3mg/ml多巴胺且ph为9.0的缓冲液中进行反应2h，使多巴胺在荧光薄膜表面主动聚合，以在荧光薄膜上形成聚多巴胺薄膜，即可得到上述生物芯片。其中，缓冲液可以为市售的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。

另外，该实施例还提供了一种用于检测肿瘤标记物和/或病毒的试剂盒，其包括上述的生物芯片以及金纳米粒子。其中，金纳米粒子的制备方法如下：

在三颈烧瓶中加入50ml浓度为1mm氯金酸溶液，在油浴环境下搅拌加热至沸腾，沸腾后向该溶液中快速加入5ml浓度为39mm的柠檬酸钠溶液，在这个过程中，加冷凝管进行冷凝回流，溶液逐渐变为酒红色，继续加热15分钟，然后，移除热源并持续搅拌直至室温，即得到含有金纳米粒子的水溶液，避光置于4℃保存。

实验例：

一、将上述实施例1得到的双带隙光子晶体薄膜用扫描电镜进行观察，其得到的扫描电镜图如附图3所示。从图中可以看出，本发明实施例制得的双带隙光子晶体薄膜的双层结构的光子晶体没有被破坏，仍然有序排布。

二、将上述实施例1得到的第一光子晶体薄膜、第二光子晶体薄膜以及双带隙光子晶体薄膜分别进行透射光谱测试，其得到的透射光谱如附图4所示，图4中的曲线从上往下依次为第一光子晶体薄膜、第二光子晶体薄膜以及双带隙光子晶体薄膜的透射光谱。从图中可以看出，双带隙光子晶体薄膜在808nm左右和540nm左右出现两个光学禁带。

三、将上述实施例1得到的上转换荧光纳米颗粒(nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,nd³⁺)用透射电镜观察，其得到的透射电镜图如附图5所示。从图中可以看出，该上转换荧光纳米颗粒的尺寸约为35nm。

四、对上述实施例1得到的荧光薄膜进行观察，其结构示意图如附图6所示。从图中可以看出，荧光薄膜中的纳米颗粒沉降在双带隙光子晶体薄膜的缝隙中。

五、将上述实施例1得到的上转换荧光纳米颗粒分别置于玻璃基底(glass)、第一光子晶体薄膜(opc545)、第二光子晶体薄膜(opc808)上进行自组装形成荧光薄膜，并将其对应得到的荧光薄膜与上述实施例1在双带隙光子晶体薄膜形成的荧光薄膜(opc808/545)进行发射光谱测试，其测试结果如附图7～8所示。从图中可以看出，取波长范围520nm～580nm的积分面积计算增强倍数，其中，上述实施例1在双带隙光子晶体薄膜形成的荧光薄膜的增强效果最佳，增强因子达到171倍。

六、对上述实施例1得到的聚多巴胺薄膜进行观察，其结构示意图如附图9所示。从图中可以看出，本发明实施例在荧光薄膜上形成的聚多巴胺薄膜致密均匀。

七、将上述实施例1得到的金纳米粒子用透射电镜观察，其得到的透射电镜图如附图10所示。从图中可以看出，本发明实施例制得的金纳米粒子的尺寸约为15nm。

八、取1ml上述实施例1得到的金纳米粒子在12000r/min下离心，用去离子水清洗两次，再次用1ml去离子水分散，接着，加入60ul的0.1mg/ml检测抗体，振荡1h，放入4℃冰箱10h，使检测抗体与金纳米粒子通过静电吸附连接，然后，经13000r/min离心，去除游离抗体，再分散在1ml去离子水中待用，得到修饰检测抗体后金纳米粒子的分散液。其中，对上述修饰检测抗体后金纳米粒子进行吸收光谱测试，其测试结果如附图11所示。从图中可以看出，修饰检测抗体后金纳米粒子与上述实施例1提供的上转换荧光纳米颗粒(nayf4:yb³⁺,er³⁺@nayf4:yb³⁺,nd³⁺)的发射峰位置相对应。

九、psa检测实验：如附图1～2所示，在上述实施例1得到的荧光薄膜4表面选定六个检测区域，用磷酸盐缓冲液(pbs缓冲液，ph＝7.2～7.4)将psa的捕获抗体6的浓度调整为1mg/ml，取50μl滴加在荧光薄膜4的检测区域，反应15min后使用pbs缓冲液冲洗，之后在检测区域分别滴加50μl浓度分别为0ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、12.5ng/ml的psa样本(即待测物7)，反应15min后再次用pbs缓冲液冲洗，最后在检测区域滴加50μl上述实验例制得的修饰检测抗体8的金纳米粒子9的分散液，反应15min后，用pbs缓冲液进行冲洗，干燥后对检测区域进行光谱检测，其检测结果如附图12～13所示。从图12～13中可以看出，在psa浓度为0.01ng/ml～12.5ng/ml的范围内荧光强度随待测物中psa浓度的提高而减弱，其有良好的线性关系，说明利用本发明实施例提供的生物芯片和试剂盒进行检测psa，具有较好的稳定性和便利性。需要说明的，本发明实施例只是以psa的检测实验作为其中一个例子，并不限次于此，即本发明实施例提供的生物芯片和试剂盒可以应用于抗体-抗原结合、抗体-抗原-抗体结合、核酸的特异性结合等利用特异性结合的检测方式，故其也可以用于2019-ncov等病毒的核酸、抗体等检测或者其他类型的抗原、抗体的检测。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。