清洁填充床层析柱的方法
【专利说明】清洁填充床层析柱的方法
[0001] 本发_的抟术领域 本发明涉及层析基质的清洁和/或消毒方法，和更特别涉及包括清洁/消毒步骤的层 析分离方法。本发明还涉及一种清洁和/或消毒层析柱的方法。
[0002] 发明背景 层析是当今用于生物制药工业的一种行之有效的纯化方法。典型地，含有目标生物分 子的液体进料通过含有基质颗粒（也称为树脂、介质等）的填充床的柱，配体经化学偶联于 基质颗粒。目标生物分子结合于基质上的配体并可在用洗脱缓冲液解吸附后以纯化的形式 回收。或者，在纯化的非-结合目标分子可在流通（即已经通过柱的贫液）中回收时，某些 杂质结合。
[0003] 层析基质是昂贵的，因此通常重复用来纯化后续批次的目标生物分子。为了能够 重复利用，基质通常使用碱性清洁溶液例如I M NaOH，在柱中原位清洁。碱引起强结合的污 染物的解吸附并水解蛋白质污染物。这个过程称为就地清洗，缩写为CIP。具有蛋白质配体 的介质，例如通常用于单克隆抗体处理的蛋白A介质，提出某些特别的清洁挑战，即它们比 其它介质更昂贵，因此有一种使用它们多个周期的强烈动机。在其它方面，蛋白质配体是或 多或少对碱敏感的，这对清洁溶液中的NaOH浓度设定了限制。已经开发了新的碱稳定性蛋 白A变体，见例如美国专利号8, 198. 404,其允许使用最高0. 5 M浓度的NaOH溶液用于清 洁，但清洁效率仍比通常用于例如碱-稳定的离子交换基质的I M溶液稍低。为此目的，提 出不同的清洁溶液，见例如WO 2006/126942、US 7, 052, 609和US 6, 972, 327,但它们不确 保完全除去所有物质。
[0004] 虽然使用碱性清洁溶液的CIP -般允许重复使用基质，但存在CIP后残存污染物 的问题。这尤其涉及床的入口部分，其中由于污染物的强吸附和由于溶解物质的局部沉淀 常常出现污垢。污垢减少CIP清洁溶液对该区域基质颗粒的可接近性且沉淀的物质往往难 以溶解。
[0005] 因此，需要改进的清洁程序，特别是在不同的细胞培养批次之间使用的程序。
[0006] 发明概沐 本发明的一个方面是提供一种分离方法，其中分离基质可以高基质纯度和低生物负担 重复用于多个细胞培养批次。这采用如在权利要求1中定义的方法实现。
[0007] -个优点是增强的清洗提供了一种高纯度和清洁度的基质。另外的优点是该方法 确保整个基质材料（包括固化床的任何污染的顶层）的清洁和/或消毒，并可创建具有改 进的分离效率的分层床。
[0008] 本发明的第二方面提供一种备选的分离方法，其中高纯度和清洁度的分离基质被 重复使用。这采用如在权利要求书中定义的方法实现。
[0009] 本发明的第三方面是提供一种有效清洁和/或消毒层析柱的方法。这可采用如在 权利要求书中定义的方法实现。
[0010] 本发明的其它合适的实施方案在所附的权利要求书中描述。
[0011] 附图简沐 图1.包括自依据本发明的再填充床的5个床横截切片（I =沉降的床顶部，5 =沉降 的床底部）的粒度分析的微分数量（均数）作图。A10072609 Start.#av是在柱实验之前 琼脂糖基质批号的参照分析。
[0012] 图2.包括自依据本发明的再填充床的5个床横截切片（1 =沉降的床顶部，5 = 沉降的床底部）的粒度分析的微分体积（均数）作图。A10072609 Start.#av是在柱实验 之前琼脂糖基质批号的参照分析。
[0013] 定义 表达"固化床"在此意指颗粒的体积分数高到足以使床表现为固体或可塑性（可变形） 固体的颗粒的床。在流变学方面，这可以表示使得床具有高于约100 Pa的屈服应力。在层 析特性方面，其意指该床是足够稳定的，以致液体可以通过粒子之间的间隙体积输送，而不 破坏床的结构。
[0014] 表达"液化床"在此意指颗粒的体积分数足够低，以致床表现为液体或浆液。在流 变学方面，这可以表示使得床具有低于约50 Pa的屈服应力。在处理特性方面，其意指该床 是可倾注的和可用泵抽送的。以类似的方式，表达"液化所述床"在此意指将该床转化为液 化床的行动。
[0015] 实施方案的详细描沐 在第一方面，本发明公开一种从至少一种污染物层析分离至少一种目标生物分子的方 法。该方法包括以下步骤： a) 提供包括分离基质颗粒的固化床的轴向层析柱，所述固化床被限制在底部支撑网 和可移动的顶部适配器之间； b) 在柱上从至少一种污染物分离目标生物分子； c) 提高适配器至少10%的固化床高度； d) 在足以液化所述床的条件下，使第一清洗液向上流动通过床，和； e) 重新填充液化床的基质颗粒以创建固化床并降低适配器以致它接触填充床，并任 选地压实填充床，和； f) 在柱上从至少一种污染物分离目标生物分子。
[0016] 所述柱可以是任何带有可移动的顶部适配器的轴向柱，例如Axichrom?、 Chromaf low?、BPG或XK柱（GE Healthcare)，但对于过程的自动化，如果适配器是可液压移 动的例如在Chromaflow和Axichrom柱中，则是有利的。基质颗粒可包含配体例如亲和性 配体、离子交换配体、多式配体（multimodal ligand)、螯合配体等。目标生物分子可例如 是蛋白、肽、核酸或病毒颗粒。它们可以例如是抗体、抗体片断、抗体融合蛋白、疫苗抗原、胰 岛素等。目标生物分子可应用于柱作为粗制进料，例如澄清的细胞培养上清或血浆部分，或 它们可以半纯化的形式应用，例如作为来自先前的层析步骤的洗脱液。在步骤f)中的目标 生物分子可以是与步骤b)中的目标生物分子相同的，但它也可以是不同的，以致第一目标 生物分子种类在步骤b)中被分离，而第二（不同的）目标生物分子种类在步骤f)中被分 离。在步骤b)和f)中要除去的污染物可以是非-产物-相关的，例如宿主细胞蛋白、DNA、 内毒素、病毒、细胞培养基组分等，产物相关的例如聚集体、错折叠的或其它灭活的种类、片 断、同种型等或过程相关的例如浸出的蛋白配体、病毒灭活化学物、缓冲液组分、改良试剂 等。在步骤b)和f)中的分离可以是结合-洗脱分离的形式，即目标生物分子吸附在基质 颗粒上，然后用洗脱缓冲液解吸附/洗脱。或者，分离可以是流通分离的形式，其中污染物 吸附在基质颗粒上和目标生物分子从流通部分回收。分离还可以中间模式进行，其中从流 通部分和洗涤/洗脱溶液二者回收目标生物分子，例如如在WO 2006/99308中所描述的，该 文献通过引用以其全文结合到本文中。
[0017] 升高适配器以对床的液化给出足够的空间，因为在床中的颗粒的体积分数必须增 加以允许液化。适配器可例如升高至少10%或15%，例如至少25%或至少35%、10-250%、 10-35%、10-25%、15-250%、15-35%、100-250%或25-250%的固化床高度。适配器的少许升高 意味着液化床的体积小，结果清洗液量可以保持在低水平。在其它方面，向上的流速将不得 不小心控制，以抵消基质颗粒朝向适配器的沉降和收集。较高的升高使得容易控制流速，但 需要较高量的清洗液。这在一定程度上可以通过再循环清洗液，可能时经由过滤器抵消。适 配器的升高可通过外力，例如液压系统进行，但它也可以通过步骤d)中的清洗液的流动进 行。在这种情况下，步骤c)通过释出适配器作为步骤d)的部分进行，这样它能够以垂直方 向自