专利名称：在线单生物分子检测芯片的制作方法
技术领域：
本发明是一种用于单生物分子检测的芯片，尤其是一种将样品注样、分离、反应和检测在一个芯片上完成的单生物分子检测芯片的制作方法。
背景技术：
从分子水平上快速有效地检测单个生物分子，特别是检测细胞表面所特有的一些生物分子，如受体研究相应的生物学性质之间的关系等，对分子生物学的研究及其在医学和生物技术上的应用具有重要意义，它不仅有助于我们研究生物大分子(蛋白质、多肽、核酸、酶、多糖和糖复合物、指类、激素等)和结构(特别是三维结构)、性质、生物合成的调控过程，从而研究DNA分子的碱基排序，理解基团的结构、组织和表示基团(如tRNA)的高级结构、了解RNA与蛋白质相互识别和作用的分子结构基础及动力学行为等而且为疾病的早期诊断(如病毒感染、肿瘤发生的早期细胞蜕变等)提供了一种有效方法。
然而，这些已有的单分子检测技术在实际应用中也存在以下一些不足(1)目标分子必须事先进行选择和分离，这样势必降低单分子的检测速度，难以推广到临床上的在线检测；(2)近场光纤对目标分子的定位是单分子检测技术在实际应用中最费时、费力的操作，如果目标分子的浓度本身就低，再加上光纤定位困难，将直接影响单分子检测的效率和结果。
三、技术内容1、发明目的本发明的目的就是提供一种在一个芯片上将反应器、过滤器集成在一起，以实现样品注样、分离、反应和检测在一个芯片上完成的在线单生物分子检测芯片的制作方法。
2、技术方案本发明的在线单生物分子检测芯片的制作的方法为(1)在玻璃或硅或塑料等基片上制出所需截面形状的微米级的微管道网络，(a)对基片表面进行改性处理，由亲水性转变为疏水性；(b)用LB膜技术在基片表面组装厚度为几百纳米的抗蚀层，对抗蚀层进行前烘处理；(c)膜、曝光；(d)用甲基异丁基甲酮和异丙醇的混合物显影；(e)对抗蚀层进行后烘处理；(f)用腐蚀液刻蚀沟槽。(2)在检测区内组装具有分子识别与相互作用的单分子层，(a)基片表面进行羟基化处理；(b)基片清洗、干燥；(c)将带有功能基团的硅烷藕联剂溶解与纯苯溶剂相混合形成稀溶液，再将基片置于该稀溶液中，在基片表面形成具有分子识别与相互作用的单分子层，(d)取出基片漂洗、干燥。对基片表面进行改性处理的方法是将基片置于六甲基二硅烷中，对抗蚀层进行前烘处理的温度为80～100℃，时间为10～30分钟，掩膜、曝光时的电子束能量为15～25KV，曝光剂量为5×10-5～2×10-6C/cm2，甲基异丁甲酮和异丙醇的混合比例为1∶1，对抗蚀层进行后烘处理的温度为120～140℃，时间为10～30分钟，用腐蚀液刻蚀沟槽的宽度和深度均为10～15微米，基片表面进行羟基化处理的方法是将基片置于60～90℃的浓硫酸～重铬酸钾洗液中5～6小时，纯苯溶液的制作方法是将无水CaCl3加入苯溶液中12小时以上，然后蒸馏提纯，得到纯苯溶剂，将带有功能基团的硅烷藕联剂溶解在纯苯溶液中形成的稀液在浓度为10～30摩尔/升。
3、技术效果①由该方法制作的检测芯片由于样品注样、分离、反应和检测高度集成在一个芯片下，使得在实际应用中对生物分子的检测效率大大提高；②分子组装结合光刻制作限域图形，能够实现目标物的精确定位；③芯片投入批量生产后，由于它的低成本，可以作为一次性使用品，可以在生物分子学、医学和生物技术领域获得更加广泛的应用。
④这种制作方法在具备一定的装置前提下，实施起来容易，预期芯片制作成品率98％以上。
⑤这种制作方法的提出，对传统的单分子检测方法起到革命性的推动作用，在这种制作框架下，人们还可以发展一些功能更全、更新的各种检测芯片。
具体实施例方式
实施例第一步基于微光电系统(MEMS)制造技术，在硅基片上制出微米量级的微管道网络。
(1)对基片表面进行改性处理，用六甲基二硅烷(HMDS)溶液经旋涂法涂布于硅片表面，在140℃左右加热数分钟，形成疏水性的有机单分子层，以增强光刻胶与基片表面的粘附性；(2)用LB膜技术在基片表面组装厚度为几百纳米的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)抗蚀层，再对抗蚀层进行前烘处理，温度为100℃，时间为30分钟；(3)掩模、曝光，电子束能量选为15KV，曝光剂量为5×10-5C/cm；(4)用甲基异丁基甲酮和异丙醇的1∶1混合物在20℃下显影2分钟；
(5)后烘温度120～140℃，时间为30分钟；(6)用腐蚀液在30℃下，以刻蚀速度100nm/min的速度刻蚀深度和宽度10～15μm的沟槽。
第二步在检测区域内组装具有分子识别与相互作用的单分子层，用于生物分子的精确定位。
(1)在硅片表面首先进行羟基化处理，将硅片置于70℃的浓硫酸-重铬酸钾洗液中6小时；(2)取出基片用蒸馏水漂洗5～6次，再用超纯水漂洗5～6次；(3)在100℃下干燥30分钟；(4)将无水CaCl3加入苯溶液中12小时，然后蒸馏提纯，得到纯的苯溶剂；(5)将带有功能基团的硅烷藕联剂溶解在苯溶剂中，配成20mol/L的稀溶液；(6)将基片置于硅烷藕联剂溶剂中，室温下放置数小时，在基片上形成具有分子识别与相互作用的单分子层；(7)取出基片依次用苯和丙酮漂洗7～8次，让其在清洁的器皿中自然干燥。
权利要求
1.一种在线单生物分子检测芯片的制作方法，其特征在于制作的方法为(1)在玻璃或硅或塑料等基片上制出所需截面形状的微米级的微管道网络，(a)对基片表面进行改性处理，由亲水性转变为疏水性；(b)用LB膜技术在基片表面组装厚度为几百纳米的抗蚀层，对抗蚀层进行前烘处理；(c)掩膜、曝光；(d)用甲基异丁基甲酮和异丙醇的混合物显影；(e)对抗蚀层进行后烘处理；(f)用腐蚀液刻蚀沟槽；(2)在检测区内组装具有分子识别与相互作用的单分子层，(a)在基片表面进行羟基化处理；(b)取出基片清洗、干燥；(c)将带有功能基团的硅烷藕联剂溶解与纯苯溶剂混合形成稀溶液，再将基片置于该稀溶液中，在基片表面形成具有分子识别与相互作用的单分子层；(d)取出基片漂洗、干燥。
2.根据权利要求1所述的在线单生物分子检测芯片的制作方法，其特征在于对基片表面进行改性处理的方法是将基片置于六甲基二硅烷中。
3.根据权利要求1所述的在线单生物分子检测芯片的制作方法，其特征在于对抗蚀层进行前烘处理的温度为80-100℃，时间为10～30分钟。
4.根据权利要求1所述的在线单生物分子检测芯片的制作方法，其特征在于掩膜、曝光时的电子束能量为15～25KV，曝光剂量为5×10-5～2×10-6c/cm2。
5.根据权利要求1所述的在线单生物分子检测芯片的制作方法，其特征在于甲基异丁甲酮和异丙醇的混合比例为1∶1。
6.根据权利要求1所述的在线单生物分子检测芯片的制作方法，其特征在于对抗蚀层进行后烘处理的温度为120～140℃，时间为10～30分钟。
7.根据权利要求1所述的在线单生物分子检测芯片的制作方法，其特征在于用腐蚀液刻蚀沟槽的宽度和深度均为10～15微米。
8.根据权利要求1所述的在线单生物分子检测芯片的制作方法，其特征在于基片表面进行羟基化处理的方法是将基片置于60～90℃的浓硫酸～重铬酸钾洗液中5～6小时。
9.根据权利要求1所述的在线单生物分子检测芯片的制作方法，其特征在于纯苯溶液的制作方法是将无水CaCl3加入苯溶液中12小时以上，然后蒸馏提纯，得到纯苯溶剂。
10.根据权利要求1所述的在线单生物分子检测芯片的制作方法，其特征在于将带有功能基团的硅烷藕联剂溶解在纯苯溶液中形成的稀溶液浓度为10～30摩尔/升。
全文摘要
在线单生物分子检测芯片的制作方法是一种将样品注样、分离、反应和检测在一个芯片上完成的单生物分子检测芯片的制作方法,其制作方法为:(1)在玻璃或硅或塑料等基片上制出所需截面形状的微米级的微管道网络。(a)对基片表面进行改性处理,由亲水性转变为疏水性;(b)用LB膜技术在基片表面组装厚度为几百纳米的抗蚀层,对抗蚀层进行前烘处理;(c)掩膜、曝光;(d)用甲基异丁基甲酮和异丙醇的混合物显影;(e)对抗蚀层进行后烘处理;(f)用腐蚀液刻蚀沟槽;(2)在检测区内组装具有分子识别与相互作用的单分子层。(a)在基片表面进行羟基化处理;(b)取出基片清洗、干燥;(c)将带有功能基团的硅烷藕联剂溶解与日俱增纯苯溶剂混合形成稀溶液,再将基片置于该稀溶液中,在基片表面形成具有分子识别与相互作用的单分子层;(d)取出基片漂洗、干燥。
文档编号G01N33/53GK1342904SQ0113411
公开日2002年4月3日 申请日期2001年10月30日 优先权日2001年10月30日
发明者顾宁, 张海黔, 马明, 虞伟, 陈功 申请人:东南大学