专利名称：抗α－胞衬蛋白多肽抗体测定在干燥综合征诊断中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及α-胞衬蛋白多肽的制备及其做为抗原在检测干燥综合征及其它疾病中的应用。
近年来，人们对干燥综合征的病因及发病机理进行了大量研究，但至今无突破性进展。目前在临床上尚未发现理想的血清学诊断方法，除临床症状外，主要靠唇腺活检及腮腺造影等有创检查明确诊断，由于患者的医从性差，常常延误诊断，并丧失最佳的治疗时机。因此，寻找一种敏感性强、特异性高而又简便易行的检测方法，对干燥综合征的早期诊断及治疗具有重要意义。为此，本发明人经过多年研究发现了可以用于干燥综合征早期诊断的血清学特异性抗原——α-胞衬蛋白多肽(亦称α-胞影蛋白多肽)，该多肽可以特异性的识别干燥综合征患者血清中的特异性抗体——抗α-胞衬蛋白多肽抗体(亦称抗α-胞影蛋白多肽抗体)，该抗体可通过一些较为简便的免疫学检测方法(如酶联免疫吸附法)检测出来。并且具有很高的敏感性和特异性。
本发明的另一目的是提供所述的α-胞衬蛋白多肽在诊断干燥综合征中的用途。
最后，本发明提供了将含有所述α-胞衬蛋白多肽及类似物做为抗原用于检测干燥综合征的方法。
本发明所用术语“α-胞衬蛋白多肽”指具有共同序列RQKLEDSYRFQFFQRDAEEL(即Arg-Gln-Lys-Leu-Glu-Asp-Ser-Tyr-Arg-Phe-Gln-Phe-Phe-Gln-Arg-Asp-Ala-Glu-Glu-Leu)的氨基酸或多肽或类似物。
Fodrin(又称胞衬蛋白或胞影蛋白)最早在神经细胞的胞浆内被发现，主要聚集在神经细胞和淋巴细胞的浆膜下，与浆膜平行呈板状分布。它是真核细胞膜骨架的主要组成部分，类似圆柱体结构，含有α和β两个亚单位。前者的分子量为240KD，后者为235KD。α、β亚单位以边对边的形式形成异二聚体，其间以二硫键相连。这种异二聚体进一步以尾对尾的形式形成四联体，并与肌钙蛋白相连，成为膜骨架的基本结构，参与细胞的运动及维持细胞的连接和形态，可能与周围神经，脑，肾脏，肝脏及全身性自身免疫病的发生有关(1)。
1997年日本德岛大学医学院的Haneji等人从干燥综合征模型NFS/sld小鼠的腮腺组织中分离出一种分子量为120kD的抗原，并发现该抗原在干燥综合征患者的唇腺组织中有大量表达，而在正常人中并未检出；同时还发现该抗原能够刺激干燥综合征患者外周血中的T淋巴细胞增殖；为了鉴定该抗原，Haneji等人将其氨基端的序列进行测定，结果发现该抗原即为非红细胞膜谱蛋白(nonerythroid α-spectrin)α-胞衬蛋白。该小组人员继而用基因工程的方法，用GST融合蛋白表达系统构建了带有编码α-胞衬蛋白氨基端序列cDNA的融合蛋白表达系统——pGEX-2T/JS-1，(JS-1为编码α-胞衬蛋白氨基端序列的碱基序列，该段序列共1784个碱基)，该表达系统表达出的α-胞衬蛋白融合蛋白分子量约为97.4kD。将纯化出的α-胞衬蛋白融合蛋白做为抗原，用免疫印迹(Westernblot)的方法检测了43例原发性干燥综合征(pSS)、8例继发干燥综合征、21例系统性红斑狼疮(SLE)、14例类风湿关节炎(RA)患者和15例正常献血者，结果显示该蛋白在原发性干燥综合征中的阳性率为95.3％，继发干燥综合征中为50％，而在SLE、RA和正常人中未检测到该抗体(2)。然而，Watanabc等人的用重组的98kD的α-胞衬蛋白做为抗原，用Westem blot的方法在不同疾病中检测的阳性率为原发性干燥综合征78％(7/9)，LE继发SS60％(9/15)，LE7％(3/44)(3)。Witte等人用ELISA的方法，将重组的93kD的α-胞衬蛋白做为抗原检测出的原发干燥综合征患者阳性率为55％(47/85)，SLE继发SS的为40％(6/15)，RA继发SS的为43％(3/7)，RA为41.6％(5/12)，SLE为20％(1/50)，正常人组为1.9％(3/160)(4)。
基于以上研究，本发明人经过序列分析发现α-胞衬蛋白中有一段氨基酸，序列与鼠非红细胞膜谱蛋白序列同源，同时该序列中具有四个保守或较保守的氨基酸，可能与该蛋白的抗原特性有关，并在干燥综合征的发病中发挥重要作用，迄今为止，国内外尚无关于该序列的抗原性及其在干燥综合征诊断中意义的研究。该序列为RQKLEDSYRFQFFQRDAEEL(即Arg-Gln-Lys-Leu-Glu-Asp-Ser-Tyr-Arg-Phe-Gln-Phe-Phe-Gln-Arg-Asp-Ala-Glu-Glu-Leu)，称为α-胞衬蛋白多肽。本发明人将该多肽作为抗原，用ELISA的方法检测干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及正常人血清中的α-胞衬蛋白多肽抗体，结果发现该多肽对干燥综合征的诊断具有较高的敏感性和特异性，可以用于干燥综合征的诊断，从而达到通过血清学的方法诊断干燥综合征的目的，为干燥综合征的临床诊断提供客观的实验室依据。
本发明的α-胞衬蛋白多肽及其类似物可通过多种方法(例如酶联免疫吸附法、免疫印迹法、金标记法等)对干燥综合征患者进行检测，其检测方法为本领域技术人员所熟知的。同时，检测的抗α-胞衬蛋白多肽抗体类型可为IgG型、IgA型或其它类型的免疫球蛋白。
本发明所述的α-胞衬蛋白多肽可以用本领域人员所熟知得方法得到，例如固相合成法、基因工程表达纯化法等。
实施例实施例1 α-胞衬蛋白多肽的设计及合成前述的研究工作(1-4)已经证明，利用基因工程的方法纯化出的α-胞衬蛋白融合蛋白能够特异性的结合干燥综合征患者体内的α-胞衬蛋白抗体，然后通过特定的方法可以将其检出。本发明的试验中首先利用Flechsler等(5)报道的固相合成法合成了一条共20个氨基酸的α-胞衬蛋白多肽，其序列如下RQKLEDSYRFQFFQRDAEELArg-Gln-Lys-Leu-Glu-Asp-Ser-Tyr-Arg-Phe-Gln-Phe-Phe-Gln-Arg-Asp-Ala-Glu-Glu-Leu该序列为非红细胞膜谱蛋白(nonerythroid α-spectrin)α-胞衬蛋白的氨基段序列。
研究表明上述α-胞衬蛋白多肽具有能特异性的识别干燥综合征患者血清中的特异性抗体的作用，对干燥综合征的诊断具有重要的意义。实施例2 α-胞衬蛋白多肽对干燥综合征患者血清中抗体的检测本研究采用酶联免疫吸附法(即ELISA法)对干燥综合征、类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中的抗α-胞衬蛋白多肽抗体进行检测，以评价该多肽抗体在各种疾病中的分布。
首先将α-胞衬蛋白多肽包被于酶联免疫吸附微孔板上，与待测血清一起孵育，如果血清中存在的抗α-胞衬蛋白多肽抗体，该抗体就会与包被的固相抗原结合，形成抗原-抗体复合物。将未结合的抗体及其它成分冲洗干净后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG抗体(IgG-HRP)一起孵育，此时IgG-HRP就会与抗原-抗体复合物结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，洗去未结合的成分，加入底物，若血清中含有抗α-胞衬蛋白多肽抗体，则会显出特定的颜色，且抗体滴度越高颜色越深。加终止液后在450nm波长下测定OD值。检测原理示意图见
图1。
本研究共检测干燥综合征患者39例，系统性红斑狼疮患者25例，类风湿关节炎患者20例，正常人59例。采用待测标本OD值(A值)＞正常人平均OD值(X)±2×标准差(2s)为阳性阈值。
本实施例主要通过以下几个方面阐明本发明多肽在干燥综合征患者诊断中的意义1、α-胞衬蛋白多肽抗体阳性率在干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及正常人的比较。
本研究用ELISA方法检测了α-胞衬蛋白多肽抗体在干燥综合征、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及正常人的阳性率(表1，图2)。应用u检验比较各组数据，结果显示，α-胞衬蛋白多肽抗体在原发和继发性干燥综合征的阳性率显著高于类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和正常人，p值均＜0.05。原发和继发性干燥综合征的α-胞衬蛋白多肽抗体的阳性率相近，无统计学差异。而α-胞衬蛋白多肽抗体在系统性红斑狼疮和类风湿关节炎的阳性率显著高于正常人(p＜0.05)。
表1. α-胞衬蛋白多肽抗体在不同疾病的阳性率抗α-胞衬蛋白多肽抗体诊断 例数 u值p值阳性例数 阳性率(％)干燥综合征 39 30 76.9原发性 31 24 77.40.13 ＞0.05*继发性 8675 0.12 ＞0.05系统性红斑狼疮 25 624 4.23 ＜0.01类风湿关节炎 20 840 3.04 ＜0.05正常人 59 23.8 6.43 ＜0.01*包括SLE继发SS患者1例，RA继发SS者5例，皮肌炎继发SS、未分化结缔组织病继发SS患者各1例。2、抗α-胞衬蛋白多肽抗体在干燥综合征、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎及正常人滴度的比较。
由表2可见α-胞衬蛋白多肽抗体在干燥综合征的滴度明显高于SLE患者和正常人。但是，与RA患者相比，α-胞衬蛋白多肽抗体与SS的滴度无明显差异。考虑该8例α-胞衬蛋白多肽抗体阳性的RA患者的年龄较大、病程较长，可能会发展为继发性干燥综合征，可追踪调查以明确。本研究中，2例与α-胞衬蛋白多肽反应正常人的血清滴度显著低于干燥综合征患者。
表2. SS、SLE、RA及正常人抗α-Fordin抗体滴度的比较检测阳性 阳性率OD值 t值P值△例数例数 (％)(M±SD)原发SS31 2477.4 0.29±0.08继发SS8 6 75 0.34±0.09 1.322 0.194SLE 25 6 24 0.23±0.09 2.933 0.005*RA20 8 40 0.28±0.09 0.761 0.450正常人59 2 3.80.17±0.04 7.415 0.000*3、α-胞衬蛋白多肽抗体与原发性SS、SLE及RA患者病程及年龄的关系。
由表3可见，31例α-胞衬蛋白多肽抗体阳性的原发性干燥综合征患者中，病程在8年以内者的α-胞衬蛋白多肽抗体的阳性率似与病程无关。但是，病程超过8年的8例患者的α-胞衬蛋白多肽抗体均为阳性，提示α-胞衬蛋白多肽抗体可能与病情程度有关，随病程延长阳性率增加。
α-胞衬蛋白多肽抗体的阳性率与原发性干燥综合征患者的年龄无明显关联。
表3.α-胞衬蛋白多肽抗体与干燥综合征患者病程的关系病程(年) 12345678 ＞8 合计阳性数63252311 831总例数83462332 839百分率(％)75 100 50 83 100 100 33 50 100 77.4对α-胞衬蛋白多肽抗体与类风湿关节炎患者年龄及病程关系的分析发现，α-胞衬蛋白多肽抗体阳性的类风湿关节炎患者的年龄较大且病程较长，与α-胞衬蛋白多肽抗体阴性RA患者比较有明显差异(表4)。但是，系统性红斑狼疮的α-胞衬蛋白多肽抗体阳性率似乎与患者的年龄和病程无关。
表4.RA和SLE中α-胞衬蛋白多肽抗体与患者的年龄和病程的关系α-胞衬蛋白多肽抗体阳性α-胞衬蛋白多肽抗体阴性例数 年龄(岁) 病程(年) 例数 年龄(岁) 病程(年)RA 870±5.2a9.3±3.7b12 52±13.6 3.5±3.0SLE631±5.66±4.4 19 30±4.3 5±6.4a与α-胞衬蛋白多肽抗体阴性组比较，t＝2.48，p＜0.05。
b与α-胞衬蛋白多肽抗体阴性组相比，t＝1.99，p＜0.05。4、α-胞衬蛋白多肽抗体与原发性干燥综合征患者脏器受累的关系。
由表5可见，原发性干燥综合征患者的肺纤维化等内脏受累率与α-胞衬蛋白多肽抗体有关，并且统计学上的差异显著，显示α-胞衬蛋白多肽抗体阳性患者脏器受累率高于α-胞衬蛋白多肽抗体阴性者。
表5.α-胞衬蛋白多肽抗体与原发性干燥综合征患者脏器受累的关系α-胞衬蛋白多肽抗体α-胞衬蛋白多肽抗体P值例数 ％例数 ％脏器受累例数 13 41.9225肺纤维化 10 32.2113 ＜0.05血管炎 10 32.2113 ＜0.05肝硬化 3 9.7 00＜0.05肾功能不全 3 9.7 00＜0.05脾功能亢进 2 6.4 1135、α-胞衬蛋白多肽抗体等自身抗体在干燥综合征的敏感性和特异性的比较。
表6显示了α-胞衬蛋白多肽抗体、SSA抗体、SSB抗体及ANA在干燥综合征中的敏感性和特异性。SSB抗体的特异性明显高于α-胞衬蛋白多肽抗体、SSA抗体和ANA，但敏感性仅为17.9％，显著低于α-胞衬蛋白多肽等抗体。因此，结合敏感性和特异性，α-胞衬蛋白多肽抗体在诊断中的意义可能优于其他自身抗体。
表6 自身抗体在干燥综合征的敏感性和特异性抗体类别阳性例数敏感性(％) 特异性(％)α-胞衬蛋白多肽抗体3179.5 87.4SSA抗体1743.6 84.7SSB抗体7 17.9 100ANA1743.6 72.6△原发性SS与继发性SS、SLE、RA和正常人相比*P＜0.01，差异非常显著。
参考文献1.Cheney R，Hirokawa N，Levine J，Willard M，Intracellular movement of Fodrin.CellMotil 1983；3(5-6)649-55.53232.Haneji，N.，Nakamura T，Takio K，et al.Identification of α-Fodrin as a candidateautoantigen in primary Sjogren’s Syndrome.Science 1997；276604-7.3.Watanabc T，Tsuchida T，Kanda N，et al.Anti-α-Fodrin antibodies in Sjogren’s Syndromeand lupus erythematosus.Arch Dermatol 1999；135535-539.4.Witte T，Matthias T，Arnett C F，et al.IgA and IgG autoantibodies againstα-Fodrin asmarker for Sjogren’s Syndrome.J Rheumatol 2000；272617-20.5.Anderson EC，et alProc，Natl.Acad.USA 957574-79，1998.
序列表<110>北京大学人民医院<120>抗α-胞衬蛋白多肽抗体测定在干燥综合征诊断中的应用<140><141>2002-08-06<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20(氨基酸)<213>人工序列<223>合成<400>1Arg Gln Lys Leu Glu Asp Ser Tyr Arg Phe Gln Phe Phe Gln ArgAsp Ala Glu Glu Leu
权利要求
1.具有α-胞衬蛋白(α-Fodrin)序列RQKLEDSYRFQFFQRDAEEL(即Arg-Gln-Lys-Leu-Glu-Asp-Ser-Tyr-Arg-Phe-Gln-Phe-Phe-Gln-Arg-Asp-Ala-Glu-Glu-Leu)的氨基酸、多肽类似物及蛋白。
2.含权利要求1的α-胞衬蛋白多肽或其类似物的诊断试剂盒。
3.含权利要求1的α-胞衬蛋白多肽或其类似物用于ELISA检测试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种α－胞衬蛋白多肽及其类似物用于干燥综合征的检测。这种多肽抗原可特异性的结合干燥综合征患者体内的特异性抗体，具有很高的敏感性和特异性。
文档编号G01N33/531GK1403819SQ02130999
公开日2003年3月19日 申请日期2002年9月23日 优先权日2002年9月23日
发明者栗占国 申请人:北京大学人民医院