专利名称：可自编码光谱识别树脂微球的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学和组合化学技术领域，具体涉及一种可自编码光谱识别树脂微球。该树脂微球利用其自身聚合单体具有不同的红外和拉曼光谱指纹峰的特性，采用不同单体共聚，得到树脂微球都具有独特的红外和拉曼特征吸收光谱。再将其转换成可识别的条型码，用于微球的快速筛选识别。
常用的编码方法有两种，一是在对固相基质进行可检测识别的物理编码，如用激光在树脂微球打上标记，但这种方法成本高昂；另一类方法则是通过在合成过程中对载体进行化学标记，从而得到与过程相关的唯一确定、可检测的化学标记，这种方法需要在合成反应中进行一系列的平行标记反应，从而大大增加了反应的复杂性。(如Mikhal S.Shchepinov等人用三苯甲基作为标记物，通过三苯甲基在反应历程中与不同的化合物基团结合产生特征来标记编码。见Tetrahedron，Vol.56(2000)，2713-2724)
为实现上述发明目的，一种可自编码光谱识别树脂微球，其特征在于该树脂微球主要由基本单体、用于特征编码的共聚单体和活性基团共聚单体组成，所述基本单体为苯乙烯或苯乙烯的苯环上烷基取代的同系物，共聚单体为至少一种且不同于基本单体的苯乙烯同系物，基本单体的质量百分比高于每一种共聚单体的质量百分比。
上述活性基团共聚单体为氯甲基苯乙烯，以在苯乙烯树脂上进行组合化学固相反应。同样可以通过对对聚苯乙烯树脂的上对氯甲基进行化学修饰或改性，可得到不同的衍生型苯乙烯固相合成树脂(如Wang氏树脂等)。
目前，实验室和市场上可用于组合化学固相合成的树脂基本有3类1.Merryfield树脂类；2.聚乙二醇接技交联苯乙烯树脂类；3.带三苯甲基聚苯乙烯树脂类。本发明通过对固相载体树脂微球的本身不同化学组分的红外和拉曼吸收光谱进行特征编码，将编码过程整合入固相载体本身的化学合成中，对所有树脂均可适用，且无需进行昂贵的显微物理标记和复杂的化学平行反应标记。更为便利的是，这种编码标记的树脂微球可以大量合成，成为一种标准化的商品化学试剂，而且对反应本身不带来任何影响，可满足不同性质、不同要求的组合化学库的建立和筛选。对树脂微球进行编码主要是通过的在树脂合成中添加具有不同红外和拉曼光谱指纹的共聚单体。
图4为编码树脂微球的红外吸收光谱1；图5为编码树脂微球的红外吸收光谱2；图6为编码树脂微球的红外吸收光谱3；图7为编码树脂的条形编码；图8为六肽的编码合成筛选。
以苯乙烯、或以苯乙烯的苯环上烷基取代的同系物为树脂的基本单体，另外至少一种不同的苯乙烯同系物共聚单体，即苯环上有各类取代基团的苯乙烯同系物(见
图1)。
由于共聚单体含量低于20％时，在目前技术条件下，其红外和拉曼特征光谱均不明显。因此，其最低组分含量决定于检测的仪器和手段。在现有的检测手段下，每一种参加交联聚合的苯环取代苯乙烯同系物占交联苯乙烯单体总量的20％以上为宜。
每种作为共聚单体的苯乙烯同系物的含量占聚合反应物(即所有参与聚合反应的组分)总质量的20％以上，但均低于基本单体的质量百分比，另外还含有5-20％的氯甲基苯乙烯。通过添加不同的苯乙烯同系共聚单体及改变其组合方式，得到一类具有不同红外和拉曼特征吸收光谱的、可用于组合化学固相合成的苯乙烯树脂微球。虽然可以用悬浮聚合、分散聚合、本体聚合和乳液聚合反应等常用树脂合成方法得到覆盖整个微米和纳米数量级直径的苯乙烯树脂微球，但目前国内外红外和拉曼光谱仪的检测最小分辨率仅为5微米，国外对单个树脂微球的红外光谱检测极限为50微米，且目前常用的固相合成树脂粒度多在80-200微米。因此，目前具有相对应用价值的编码树脂微球的粒径分布范围仅限在50-500微米之间。不过，随着检测技术与组合化学合成技术的进步，其有效范围将随之扩宽。
2、悬浮聚合将混合后的原料加入含200毫升去离子水的聚合反应器中(如500毫升四口烧瓶)，充氮气保护，逐步升温到80℃，以300-400转/分钟速率持续搅拌，连续反应24小时，以停止搅拌时，油层消失，所有微球均沉淀于反应器底部为反应终点。升温至95℃熟化1小时，倒出过滤，收集微球，于室温下0.1大气压真空干燥24小时。
3、树脂后处理所得树脂微球需分级过筛，再用无水乙醇和去离子水各循环抽提24小时，在室温下0.1大气压真空干燥24小时后得到成品(见图2和图3)。
4、编码树脂的编码和建库
不同编码的树脂微球分别进行红外和拉曼光谱检测，得到不同的特征光谱图(见图4-6)。通过多批次、不同浓度的一种编码树脂在不同红外和拉曼光谱仪上进行重复检测的验证，确认其特征光谱的普适性，消除合成过程和检测条件的影响因素，用软件读入其特征光谱图，作可视化编码转换得到条形编码(见图7)，并将其建入标准数据库中。
2、悬浮聚合将混合后的原料(5-10克)加入含200-250毫升去离子水的聚合反应器中(如500毫升四口烧瓶)，充氮气保护，逐步升温到60℃，以300-350转/分钟速率持续搅拌，连续反应30小时，以停止搅拌时所有微球均沉淀于反应器底部为反应终点。升温至95℃熟化1小时，倒出过滤，收集微球，于室温下0.1大气压真空干燥24小时。
3、树脂后处理4、编码树脂的编码和建库(3、4步骤均同实施例1)
以苯乙烯为基本单体的1-20微米编码微球的制备1、原料配比
原料的预处理见实施例1。
2、分散聚合将混合原料(10-15克)与30毫升甲基纤溶剂和20毫升无水乙醇一起倒入200毫升锥形瓶中，充分振荡直到得无色溶液。同时向250毫升三口烧瓶中预先通入氮气30分钟后，将混合液倒入，以250-300转/分钟转速搅拌，水浴升温至75℃，持续反应10-12小时。反应完成后，撤去水浴，继续搅拌降温至室温，得白色乳浊液。
3、树脂后处理将含树脂乳液分别用等体积去离子水、丙酮、乙醇各洗2-3次，洗涤后在高速离心机下高速离心，去上清层。在无水乙醇中超声分离树脂微球，高速离心去上清，重复5-6次。等体积去离子水洗3次，高速离心去上清层。
4、编码树脂的编码和建库由于受红外光谱仪的仪器分辨率限制，1-20微米树脂微球只能进行拉曼光谱的编码和建库工作，具体步骤同实施例1。
2、乳液聚合将混合后的原料(5克)加入含120毫升去离子水和80毫升丙酮的聚合反应器中(如500毫升四口烧瓶)，充氮气保护，逐步升温到75-85℃，以250-350转/分钟速率持续搅拌，连续反应30小时，得到乳浊液。
3、树脂后处理将含树脂乳液分别用等体积去离子水、丙酮、乙醇各洗2-3次，洗涤后在高速离心机下高速离心，去上清层。最后得到树脂悬浮液再用去离子水泡洗2次，每次24小时，高速离心去上清。
4、编码树脂的编码和建库由于红外和拉曼光谱仪的仪器分辩率均不足以对纳米级大小的单个树脂微球进行光谱检测，此项工作目前还不能进行。但随着光学检测仪器的不断升级换代和性能提升，纳米级的编码树脂微球在未来将具有其相应的应用价值和更大的应用领域。
我们以六肽全库的编码固相合成与筛选为例表明本发明编码树脂微球的用途。
如图8所示，第一步，我们将20种L-氨基酸和20种编码树脂微球一一对应，固相合成，一种氨基酸对应一种编码树脂(N1-N20)；而后，将20种微球混合，再用混分法(spit-mix)随机加上四个氨基酸生成五肽；将所有微球分成20组，编号(M1-M20)，每组各接一种氨基酸，得到20组六肽子库；经荧光标记的靶物分子进行筛选，得到荧光强度最高的微球，根据其所在组编号，可得知该微球上末位的氨基酸种类B，再经红外和拉曼光谱检测，得到该微球的编码，根据最初的一一对应关系，可得知该微球上第一位氨基酸的种类A(注，这里的A、B、C、D、E、F均为代号，而不是氨基酸的常用字母简称)。
第二步，在已知对靶分子活性最高的六肽首位和末位氨基酸序列(A和B)的基础上，先将所有20种编码微球都接上氨基酸A，再在第二个氨基酸时各种编码微球一一对应接不同的氨基酸，编码(N1-N20)；混合所有微球，混分法生成四肽；分成20组，编号(M1-M20)，每组各接一种氨基酸得到20个五肽子库，最后每组都接上氨基酸B成六肽AXXXXB(X代表未知氨基酸)；用荧光标记靶分子进行再次筛选，同理可得出活性六肽的第二位和第五位氨基酸C、D。
第三步，将20种编码微球上都先接上二个氨基酸AC，在接第三个氨基酸时，各种编码微球一一对应接不同的氨基酸，编码(N1-N20)；混合微球，分成20组，编号(M1-M20)，各接一种氨基酸生成四肽子库；然后再各接上氨基酸D和B，生成六肽ACXXDB；荧光标记靶分子第三次筛选，得出活性六肽的第三位和第四位氨基酸E、F，从而可以获知对靶分子活性最高的六肽序列是ACEFDB。
采用了编码树脂筛选法后，可以一次定位两个氨基酸序列，比起常规的逐位扫描定位法效率提高了一倍，合成肽库的工作量也大大减轻(从六肽全库的6.4×107个六肽中筛选出目标六肽只需合成60个子库，而逐位扫描法则要合成120个子库)。而且无需进行其它任何标记反应，对固相合成过程毫无影响。这一方法也可以应用到其它组合化学固相合成之中，适用于各类组合化学库的筛选。
权利要求
1.一种可自编码光谱识别树脂微球，其特征在于该树脂微球主要由基本单体、用于特征编码的共聚单体和活性基团共聚单体组成，所述基本单体为苯乙烯或苯乙烯的苯环上烷基取代的同系物，共聚单体为至少一种且不同于基本单体的苯乙烯同系物，树脂中基本单体的质量百分比应高于每一种共聚单体的质量百分比。
2.根据权利要求1所述的可自编码光谱识别树脂微球，其特征在于所述活性基团共聚单体为氯甲基苯乙烯，以在苯乙烯树脂上进行组合化学固相反应。同样可以通过对聚苯乙烯树脂的上对氯甲基进行化学修饰或改性，可得到不同的衍生型苯乙烯固相合成树脂，氯甲基苯乙烯的质量百分比为5-20％。
3.根据权利要求1或2所述的可自编码光谱识别树脂微球，其特征在于每一种用于特征编码的共聚单体的质量百分比大于20％。
全文摘要
本发明公开了一种可自编码光谱识别树脂微球，主要由基本单体、用于特征编码的共聚单体和活性基团共聚单体组成，基本单体为苯乙烯或苯乙烯的苯环上烷基取代的同系物，共聚单体为至少一种且不同于基本单体的苯乙烯同系物，基本单体的质量百分比高于每一种共聚单体的质量百分比。本发明通过对固相载体树脂微球的本身不同化学组分的红外和拉曼吸收光谱进行特征编码，将编码过程整合入固相载体本身的化学合成中，对所有树脂均可适用，且无需进行昂贵的显微物理标记和复杂的化学平行反应标记。这种树脂微球可以大量合成，成为一种标准化的商品化学试剂，且对反应本身不带来任何影响，可满足不同性质、不同要求的组合化学库的建立和筛选。
文档编号G01N21/31GK1434284SQ0311869
公开日2003年8月6日 申请日期2003年2月26日 优先权日2003年2月26日
发明者赵元弟, 杜磊, 陈同生, 骆清铭 申请人:华中科技大学