专利名称：将分子固定在表面上的方法
技术领域：
本发明涉及将化合物，特别是分子例如生物分子固定在表面或固体载体上的方法。
在一个封装件中安插多个IC(集成电路)的芯片封装技术是现有技术中已知的。在此，例如在堆叠式芯片结构中，经常采用由聚合物组成的中间层，该中间层建立了上下重叠堆积的IC的连接并同时有助于机械保护下部芯片的上表面，所述上表面可能是敏感的。在一些工厂中，这样层的生产是成批生产工艺的一部分，并特别地，这样层的厚度可以精确调控在几微米和甚至更小的范围内。
对于许多生物化学和生物技术应用有意义的是，将生物分子固定在固体载体上。在无机层和生物分子之间建立连接的交联剂通常用于在无机底物上的生物共轭。例如在EP1132739B1中公开了一种方法，该方法用于在生物共轭中，通过交联剂将分子结合到无机底物上，其中这样的交联剂可以是例如硅烷。此外，在EP1132739B1中提出一种连接物体系，该连接物体系可用于生物分子的检测和分离和用作传感芯片或生物芯片的组件或用作诊断仪器。例如在生物化学工艺过程中，可以重复采用固定酶。此外，酶和其它生物分子的固定是开发生物兼容植入物的关键技术。
总共已知有多种方法用于将分子(例如生物分子)结合到载体表面。在免疫学领域中，使用例如聚苯乙烯表面如PolySorp和MaxiSorp用于将生物分子结合或共轭到表面上。
从EP0646038已知生产钝化和稳定化的多孔载体和采用它们用于生物共轭。这些载体具有高的可逆吸着容量，其基本上不伴随出现分子例如蛋白质、多糖或寡核苷酸或多核苷酸的非特异吸附。
DE10004884描述了借助连接物类似的基团在表面上安置生物分子的方法。该方法包括将含有连接物类似的基团的聚合物与氢氧根离子源接触，由此可以将生物分子例如肝素施加到底物表面上。
与生物共轭相关，对于本领域技术人员，有两个主要问题很重要(i)总共将多少分子结合到经定义的表面上和(ii)多少分子在结合过程之后仍然具有活性。
生物共轭的已知方法的缺点是，使用连接物用于将分子结合到载体上。连接物的存在不利地降低结合分子的活性。此外，已知方法是耗时的并由于使用连接物或相应的类似物而是昂贵的。
本发明的技术问题是提供一种方法，该方法使得可以简单并且经济地将生物分子共轭或固定在表面上且其中保持最大限度地获得结合分子的活性。
此目标由根据权利要求1的特征的方法达到。本发明的有利实施方案是从属权利要求的主题。
在根据本发明的将分子固定在表面上的方法中规定，将一层疏水性和特别是非可溶胀聚合物施加到表面上并将分子固定在该聚合物层的表面上。
这样的疏水性聚合物例如是聚酰亚胺或聚苯乙烯。聚合物层所要施加到的表面优选由无机材料例如半导体材料，特别是硅，半导体氧化物，特别是二氧化硅，玻璃，氮化物，或陶瓷组成。
疏水性聚合物如聚酰亚胺或聚苯乙烯具有的优点是，可以采用半导体技术中已知的常规方法将它们施加到无机载体的表面。此外，它们使载体相对于施加到聚合物层表面的分子或与这些分子相关联的物质为电绝缘。因此，电传感器和测定电路可以集成入例如由半导体材料组成的载体中，而没有由于施加到聚合物层表面的分子和物质对它们的功能有任何有害影响。
在根据本发明的方法中，载体的表面可以完全或仅部分由有机疏水性聚合物覆盖，其中借助常用于半导体工业的掩蔽工艺可将表面的几部分留出空白。采用此方式，电连接触点(键)可以随后安装在载体上，例如安装在芯片上。也可以由于其它原因将表面的几部分留出空白，例如使得非必要为无机的表面区域未被覆盖，或相反，只由聚合物涂覆表面的这样的特定位置，在该特定位置上可随后粘附分子，例如生物分子。
为进行固定，将聚合物层与有机分子接触，该有机分子可与聚合物层形成连接。以一定的方式进行使接触的作用，使得以位置特异的方式结合分子。
优选将传感器元件在表面下方集成入载体中，在该表面上施加有聚合物层，以使得可以对聚合物层表面上固定的分子进行测量。这些测量可例如用于表征生物分子的性能或在它们周围发生的化学反应。
例如，可以良好地将抗体结合到例如由聚酰亚胺或聚苯乙烯组成的疏水性聚合物层的表面，采用该聚合物层可以容易地涂覆用作载体的半导体制品或半导体层，使得可以随后进行传统检测反应例如ELISA反应。
与本发明相关的分子特别是肽，蛋白质，基因及其片段，核酸，碳水化合物结构如糖，细胞及其片段，细胞膜组分，和/或激素。当然也可以将微生物、细胞提取物、配体、抗原、抗体、受体、外源凝集素、糖肽和/或脂类作为分子固定在聚合物层的表面上。微生物可以是活或死的微生物，其中在本发明意义中的活微生物涉及生长细胞和静息细胞两者。该微生物可以由载体上细胞的细胞内交联而预固定，其中术语“预固定”是指在按本发明方法的固定之前，可导致分子或细胞固着的所有方法。在包埋入聚合物基体中以将微生物预固定时，适宜地采用生物聚合物例如多糖或蛋白质，或还有合成聚合物。
此外，当然也可以将配体作为分子固定在聚合物层表面上。在本发明意义中的配体例如是分子，例如蛋白质或离子，它们可以在中心结构周围分成组。配体可以是单齿的和多齿的。然而，术语“配体”也可指在大分子特异部位结合的分子，例如蛋白质上的底物或辅酶。在本发明意义中，术语“分子或生物分子”也应当理解为表示抗原和/或抗体。在本发明意义中的抗原是可引起免疫应答的所有物质。它们可以是异体的天然或合成大分子，特别是蛋白质或多糖，其分子量大于2千道尔顿，以及外来粒子的表面结构。根据本发明的抗原可由高分子量部分组成，该高分子量部分用作通常为多种的低分子量基团的底物，该低分子量基团对免疫应答的特异性和抗原与相应的免疫球蛋白的反应起决定性作用。抗原可以是多价的和单价的并因此可以与一种或与多种抗体种类相互作用。
也可以设计，在载体上不固定抗原而固定抗体。术语“抗体”特别是指特异地与一种抗原相互作用的糖肽。通过相互作用导致抗原-抗体配合物的形成。抗体可以是例如不同种免疫球蛋白组。抗体可以作为完整抗体或作为不同种片段而固定，该片段可以例如通过由不同种肽酶的断裂而产生。可以在载体上的固定之前或期间或之后，例如由还原、氧化或由低聚而将抗体改性。此外，也可以使用受体作为生物分子。受体例如是与细胞外信号分子例如配体相互作用的蛋白质，并通过构型变化，特别地通过次级信使物质而活化或引发某些功能。然而，在本发明意义中的受体也可以是接受刺激并转达相应信息的特定细胞；对此例子有光受体、化学受体、热受体和压力受体。
聚合物层施加到的表面优选是极平的，即它是具有低粗糙度的表面例如半导体层或具有集成电路的半导体制品的表面(IC表面)，然而，它们可具有局部微观结构，该微观结构适于例如接受生物分子。
在本发明意义中的术语“固定或预固定”是指由化学、生物和/或物理方式限制分子移动性和溶解性的所有方法，其中术语“预固定”涉及用于固着分子的所有方法，该“预固定”在按本发明方法的固定之前进行。固定和/或预固定可以由各种方法进行，如将分子彼此结合或结合到载体上，通过在聚合物基体网络中夹持，或通过膜的包封。通过固定，不仅分子能够重复使用，而且在与样品的相互作用过程之后它们可容易地再次分离。它们可采用更高得多的局部浓度和在连续流过系统中使用。可以通过对载体的直接连接和通过交联而进行分子在载体上的结合或固定。特别地根据本发明，由离子、吸附或由共价结合进行对载体的连接。在本发明意义中的交联是分子彼此间交联或与其它聚合物交联。在通过包埋的固定中，在将分子固定在载体表面上之前将分子包埋入凝胶结构或膜中。
本领域技术人员已知将分子固定在载体上的许多可能性方案。在此，固定应以一定的方式进行，使得每个探针或分子可以归属于载体上确定的位置和可以独立地评价载体上的每个位置。然而，也可能期望，不同种分子或探针的涂覆地点部分或完全重叠，或堆放生物分子混合物。例如，固定可以由根据半导体技术的方法进行。基本上，可以采用两种原则上不同的方式将分子或生物分子固定在载体上(a)一方面，可以在载体上经定义的位置由单体的合成结构单元的连续偶合而原位合成分子，(b)另一方面，可以将预先合成的生物分子，或源自图书馆的生物分子，或其它分子，在特别官能化的载体材料的经定义的位置放下和固定。点样和印刷方法两者都可用于此目的。“点样”是指这样的方法，在该方法中在载体上放下其中存在有分子的液滴，其中通过表面相互作用和干燥形成基本上圆的点。然而，其它印刷方法也使得可以在载体表面上经定义的区域中放下分子，由此，样品对分子底物表面的稳定结合可以高偶合效率进行。本领域技术人员已知的所有在例如柱材料上固定生物分子的措施都可同样使用，以将分子固定在载体上。
固定或预固定的经选择的方法是例如接触尖端印刷、环销印刷、纳米电印刷和纳米吸移、气泡喷墨印刷、顶部点印刷、微接触印刷、微流体网络方法、光刻活化方法、光刻胶平版印刷、电化学聚焦和微湿印刷。可以根据本发明应用所有这些方法。
在本发明的意义中，包括金属、聚丙烯、特氟隆、聚乙烯、聚酯、聚苯乙烯、氮化物、陶瓷和/或玻璃的无机表面可以用作载体，或IC(集成电路)表面、硅、二氧化硅或其它。在本发明意义中的金属是其内聚是由晶格产生的所有化合物。在金属和非金属之间的界线是不清楚的，使得元素Ce、Sn、As和Sb在本发明意义中也是金属。根据本发明的金属也包括金属玻璃，即处于亚稳、极为无定形状态的材料。自然地，金属导电聚合物也是本发明意义中的金属。本发明意义中的金属有利地特别具有良好的强度，良好的硬度和耐磨性，高韧性，和良好的导电性和导热性。本发明意义中的聚丙烯是热塑性的丙烯聚合物。聚丙烯特别具有高硬度，回弹性，刚度，和耐热性的特征。根据本发明的特氟隆是聚四氟乙烯，它有利地具有良好的热塑性能。特别通过乙烯按基本上为两种不同的方法，高压法和低压法，聚合而制备聚乙烯。由高压法生产的聚乙烯有利地具有低密度。包含聚丙烯的载体的性能基本上由作为部分结晶烃的聚乙烯的特征而确定。聚乙烯有利地直到最高至60℃几乎不溶于所有的常用溶剂。有利地，极性液体如醇、酯和酮在室温下几乎不引起聚乙烯的溶胀并因此不引起载体涂层的溶胀。聚乙烯有利地对水、碱液和盐溶液以及无机酸完全不起化学作用。包含聚乙烯的载体具有例如很低的水蒸汽透过率。然而，载体也可合适地包括聚酯。本发明意义中的聚酯是由内酯开环聚合，或由羟基羧酸或由二醇和二羧酸或二羧酸衍生物的缩聚而生产的化合物。本发明意义中的聚酯也包括聚酯树脂、聚酯酰亚胺、聚酯橡胶、聚酯多元醇和聚酯聚氨酯。聚酯有利地是热塑性塑料和具有显著的材料特征。它们例如具有高热稳定性和可以与金属例如铜、铝和镁一起加工成合金。
然而也可以设计为，载体包含陶瓷。本发明意义中的陶瓷是用于特别是无机并主要为非金属化合物的集合名词，该化合物包含多于30vol％的结晶材料。本领域技术人员已知可以用作载体的各种陶瓷或陶瓷材料。这些物质例如可以是所谓的陶器、解理晶片、实验室硬瓷、氧化铝陶瓷、永磁材料、硅砖和氧化镁砖。在粘土陶瓷材料方面，在本发明意义中区分为粗和细材料，其中细粘土陶瓷材料包括土器、陶器、瓷器和硬瓷。特种陶瓷材料如玻面陶瓷、氧化物陶瓷、SiC砖和熔融铸塑砖也可有利地用作载体。载体也可优选包含玻璃。本发明意义中的术语“玻璃”是以无定形、非结晶固体状态的物质，即玻璃态可在本发明的意义中理解为冻结的过冷液体或熔体。玻璃因此是无机或有机的，主要是氧化物的熔体产物，该熔体产物经由给料过程转化成固态而没有熔体相组分结晶出来。当然，在本发明的意义中晶体、熔体和过冷熔体也理解为是玻璃。玻璃可以是例如平板玻璃、实验室仪器玻璃、铅晶质玻璃、纤维玻璃、光学玻璃纤维和其它玻璃。当然也可以使用无硅酸盐的玻璃，例如磷酸盐玻璃。然而，载体也可以这样获得，使得使用光学玻璃，即例如具有特别的光学折光指数的玻璃。
在本发明意义中当然可以将载体的表面改性。可以特别通过生物、物理和/或化学影响的作用进行载体改性。物理作用的例子是抛光、蚀刻、酸洗、喷砂，但还有导致硬化、涂覆、调质处理、用保护皮层被覆等的物理工艺。通过生物作用的表面处理可以例如包括通过微生物的长满。载体表面的化学改性包括例如采用酸、碱、金属氧化物和其它试剂的处理。载体表面可以采用一定的方式改性，使得分子特别好地粘附到载体上，或以一定方式粘附使得它们以不对其活性有害的方式加以改性。表面改性也包括采用如下物质的涂覆聚-L-亮氨酸、氨基硅烷、醛硅烷、环氧基团、金、抗生蛋白链菌素、反应性基团、聚丙烯酰胺垫、固定化硝基纤维素和/或活化醛或琼脂糖-醛基团，由该涂覆特别结合如下部分DNA、COO-基、NH2基、生物素、硫醇基团等。载体表面改性当然也包括导致提高的稳定性和断裂强度的处理。当然也可以进行特别地在生物分子固定方面，也为源自组织学的传统的表面改性。
在本发明的一个实施方案中设计，在聚合物层表面的特定区域中施加含有集成电路或附加的微系统的另外的半导体制品或半导体层。适合作为聚合物层的在此特别是聚酰亚胺，聚酰亚胺对于在半导体技术中的这样的应用是已知的。聚酰亚胺是特别耐高温的聚合物，它们有利地具有优异的机械、热和电性能。聚酰亚胺在半导体技术中的目前已知的应用特别包括载体上的缓冲层、钝化层、粘合层和介电中间层。特别将聚酰亚胺以液体形式施用并然后固化。在此固化步骤中聚酰亚胺有利地获得期望的性能。为了应用，可以将聚酰亚胺由平版印刷方式形成网纹。当然，聚酰亚胺也可用作浇注材料的粘附促进剂和用作缓冲层。聚酰亚胺层降低例如由于包覆而引起的硅中的应力和防止边缘的裂纹。必须特别在非常均匀的温度条件下固化聚酰亚胺以防止聚酰亚胺中形成裂纹和颜色的不均匀性。例如，低氧值是有利的，以达到良好的粘附。
同样可根据本发明用作用于将分子固定的聚合物层的聚苯乙烯是主要由苯乙烯的自由基聚合获得的一种热塑性塑料。由于苯环是特别稳定的结构，所以生长的聚合物链的自由基末端从不攻击环中的双键。应用聚苯乙烯方面的多种优点源自于上述事实，例如，聚苯乙酸耐酸、碱液和醇。
在本发明的进一步的有利实施方案中，仅在预先定义的区域中将疏水性聚合物施加到表面上。
在进一步特别优选的实施方案中，由等离子体处理使表面带正电荷和/或负电荷，即，表面在最不同的位置带有不同的电荷。聚合物材料特别以各种形式存在。各个形式对加工工艺提出不同的要求。依赖于表面的成形，例如等离子体以不同的方式到达表面。聚合物表面的等离子体处理可有利地极大增加表面能和使其它加工方法可行。在等离子体处理中，特别是等离子体中的离子和自由基与聚合物表面反应并在此产生官能团，该官能团有利地确定聚合物的表面性能。特别地，通过带正电或带负电实现生物分子的更好的可湿性和/或更好的结合。
在本发明的进一步的优选实施方案中，UV反应性分子通过采用UV光的辐照而共价固定。例如可以设计为，将通过使用选择性通过光刻掩模辐照的光局部结合到玻璃上的用以低聚合成的光不稳定保护性基团活化。然后采用光不稳定的分子，例如DNA碱基浇注玻璃，该DNA碱基结合到经定义的、预先辐照的阵列位置。然后相应地利用不同的光刻掩模用于序列中的下一个低聚碱基，并重复该过程。这样对于样品低聚物中的每个碱基(每个位置)需要四个掩模。这样可以直接从已知序列数据库有利地进行生产，在此达到统一的标准化。
如果疏水性分子，特别是生物分子，由上述方法之一，例如印刷方法，施加到疏水性聚合物层的表面，则这些分子基于足够公知的相互作用粘附到此表面。
为将分子固定在聚合物层表面上，在本发明方法的实施方案中设计，聚合物层的表面要在氧等离子体中至少逐步地，例如使用常规掩蔽技术活化。以此方式在聚合物层的表面上形成醛基、羧基或氢氧根。这些基团是亲水性的并使与施加到这些活化区域的生物分子的共价键合成为可能，该施加例如由采用包含这些分子的溶液的印刷进行。这些共价键合很稳定，使得其上固定有分子的聚合物层随后可在肥皂中煮沸而键不破裂。表面优选仅以小岛方式由氧等离子体处理而活化，其中聚合物层中“小岛”周围的保持疏水性的区域限制了表面上施加溶液的流径。
以下，根据实施例进一步详细描述本发明，而无意于将本发明限于这些实施例。
实施例1在旋涂机中采用大约100-200nm聚苯乙烯层覆盖含有CMOS光电二极管的硅传感器芯片。为此目的，将芯片采用200μl的0.1％(w/v)聚苯乙烯的甲苯溶液，在3000rpm下在旋涂机中涂覆一分钟。然后，在光栅状阵列中采用蛋白质溶液印刷传感器区域(光电二极管)。使用PBS缓冲剂中的抗体。在每种情况下以5μg/mL的浓度使用抗体。采用与荧光染料共轭的抗体印刷光栅的一部分。将抗体在潮湿小室中在4℃下孵化过夜，并然后采用PBS缓冲剂冲洗掉未结合的抗体。在采用蒸馏水的洗涤之后，借助于荧光测量仪检测固定的完成情况。抗体对传感器区域的成功结合由抗体的荧光证明。然后通过施加由PMMA组成的反应小室密封芯片。通过PMMA对聚苯乙烯层的接合而进行反应小室的施加。制成的结构进一步通过使用蛋白质用市售稳定剂而稳定化和备用。
实施例2采用聚酰亚胺的5μm层涂覆含有CMOS光电二极管的硅传感器芯片，该芯片已经在晶片上。然后，采用二苯酮甲基丙烯酸酯和丙烯酸的共聚物涂覆聚酰亚胺。然后以简单方式采用生物分子如DNA(在PBS缓冲剂中的5μM寡核苷酸)印刷载体。由UV辐射在300nm下进行固定大约10分钟。共聚物的二苯酮在此形成自由基，它共价键合到聚酰亚胺涂层以及键合到DNA。也可以采用所有其它生物分子如蛋白质，特别是抗体，肽，糖，脂类和甘油三酯以及其络合结构，同样进行该相同的工艺。
权利要求
1.一种将分子固定在表面上的方法，其包括如下工艺步骤-向表面施加疏水性聚合物的层，-将分子固定在所述层的表面上。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于聚合物是聚酰亚胺和/或聚苯乙烯。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于仅在预先定义的区域中将聚合物层施加到表面上。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于至少逐步地由等离子体处理使聚合物层的表面带正电荷或负电荷。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于由采用UV光的辐照而共价固定UV反应性分子。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于至少逐步地在氧等离子体中活化聚合物层。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于聚合物层表面的一部分用于施加集成电路(IC)或微系统。
全文摘要
本发明涉及一种将分子固定在表面上的方法，其中采用聚合物涂覆极平的表面，其后由该聚合物将分子固定在表面上。
文档编号G01N33/543GK1650166SQ03809594
公开日2005年8月3日 申请日期2003年4月10日 优先权日2002年4月12日
发明者霍尔格·克拉普罗特, 乌尔里希·西本, 英戈·弗罗因德 申请人:迈克纳斯公司, 迈克纳斯控股公司, 霍尔格·克拉普罗特