专利名称：一种分离提取层析柱的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物医药领域用的器材，特别是涉及一种分离提取层析柱。
背景技术：
将单一蛋白从组织提取液或蛋白混杂的溶液中纯化出来需要经历一系列很复杂和繁琐的分离提取过程，耗费时间长而最终收率却很低。随着生化技术的发展，出现一种操作简便、分离特异性高的分离纯化生物大分子的方法——亲和层析法。它的原理是利用生物大分子之间的特异性吸附或结合的特性来达到快速纯化目标蛋白的目的。
发明内容
本发明的目的是要为从事生物医学研究和制备生物制剂的人员提供出一种能够方便快捷地从杂蛋白溶液中分离纯化出热休克蛋白(HSP)，特别是纯化出热休克蛋白-多肽复合体(Heat shock protein peptidecomplexes，简称HSPPC)的层析柱。
HSP的一个非常重要的生物学特性是能够捕捉机体组织和细胞中发生变异的多肽和蛋白，或入侵病原体所携带的外源分子群作为抗原形成HSPPC，HSPPC将它们捕捉到的多肽抗原分子群递呈给T淋巴细胞，激发机体的免疫系统识别和清除变异的自身蛋白和外源的分子和细胞。
由于HSP的N端具有ATP酶的功能，因此它除能与ATP(Adenosinetriphosphate，缩写ATP，中文称三磷酸腺苷)作用外，还能特异性地与固相树脂上偶联的ADP(Adenosine 3’，5’diphosphate缩写ADP，中文称二磷酸腺苷)相亲合。HSPPC如与ATP作用，HSPPC中的多肽分子群就会从HSPPC中被解离出来，HSP的抗原递呈功能就会丧失。试验发现HSPPC与ADP结合则不发生解离。因此根据这个特点和实际需求，采用把ADP偶联到固相Agarose树脂上，当含有HSP或HSPPC的杂蛋白溶液流经层析柱内的ADP-Agarose树脂时，杂蛋白溶液中的HSP或HSPPC与固相树脂上的ADP发生亲和作用，因此HSP和HSPPC被吸附滞留在固相树脂上，而与ADP不发生亲和作用的其它杂蛋白则流过树脂不会被吸附在树脂上。ADP-Agarose层析柱不仅能方便快捷地从杂蛋白溶液中分离纯化出HSP，而且还能分离纯化出HSPPC。
本发明涉及的是制备一种“分离提取层析柱”，它的特征是由层析柱和ADP-Agarose树脂两部分组成，其中，层析柱是由中空型的管状物1和下端内置的筛板2制成，筛板的目的是允许溶液流过但防止树脂流失。筛板也可由尼龙网筛、陶瓷板、玻璃纤维等可达到相同功能的其它材料替代。层析柱的下端是溶液流出口3，可套接软胶管。将Adenosine3’，5’-diphosphate-Agasoe树脂，简称ADP-Agarose树脂4填充入层析柱内即组成分离提取层析柱。
根据层析柱的大小和填充树脂的多少可制备出大批量、各种规格的商品型ADP-Agarose分离提取层析柱。本分离提取层析柱的应用可以大幅度地减轻生物学和医学实验室纯化HSP或HSPPC的劳动强度和缩短纯化过程。
热休克蛋白是一类同源性极高、序列非常保守的存在于细胞内的家族蛋白，根据其分子大小和结构特性可分为多个成员，如HSP-27、HSP-40、HSP-60、HSP-70、HSP-90、HSP-110等蛋白主要存在于胞浆内，gp96蛋白主要存在于内质网腔内。它们平时处于低水平的表达状态，一旦细胞出现生理性、病理性或环境的突发性变化时HSP的表达便会急剧提高，因此热休克蛋白又被称为“应激蛋白”。HSP通过参与蛋白质的结合、折叠、亚单位的装配、跨膜转运及抗原递呈对细胞的生长、分化、基因转录和自我保护发挥重要作用。HSP的另一个重要特性是其具有结合入侵机体内部的外源病原体及机体内源细胞变异蛋白质和多肽的能力。它们与外源蛋白和多肽、内源变异蛋白和多肽分子群结合，形成HSPPC参与抗原递呈而其HSP本身并不产生抗原性，因此HSP又被称为“分子伴侣”。制备出一种能使生物学实验室和临床医学实验室快速、便捷和高效的分离纯化出HSP或HSPPC的层析柱在实际应用中有着迫切的需求和十分重要的意义。
应用者可根据各自实验室的条件、提取经验而调整提取条件而不必拘限于本发明所叙述的实验条件。
图1是本实用新型结构示意图。
具体实施方式
实施例11.组装层析柱(1)、Adenosine 3’，5’diphosphate-Agarose树脂(ADP-Agarose树脂)可从Sigma公司订购。
(2)、选用塑料或玻璃制造的层析用空柱。柱的规格不限，常用的有1×5cm、1.5×10cm、2×20cm等，可根据实际需求选用并批量制备，如可制备出装填有5ml、10ml、15ml等不同容量的ADP-Agarose树脂层析柱。
(3)、平衡液(20mM Tris-Acetate，20mM NaCl，，3mM MgCl2，0.5mMPMSF，15mMβ-mercaptoethanol，pH7.5)。
使用冲洗干净并干燥的层析用空柱。将平衡液充分浸泡过的ADP-Agarose树脂用吸管将树脂与平衡液一起灌装入层析柱中。使得树脂在空柱中自然沉降，直至所需容积，柱床中不得留有气泡。
柱的包装将灌装完毕的层析柱两端用封口膜密封以防止树脂干燥和污染。将封闭好的层析柱装入铝塑包装袋内封口后连同使用说明书一并放入包装盒中。
2、组织液的制备从大鼠身上取出大约1cm3的肿瘤块，用生理盐水冲洗去除血污，修去正常组织，将切割成小碎块的肿瘤组织放入-20℃冰箱中冷冻2小时后将其置入匀浆器中。向匀浆器中加入适量预冷的研磨缓冲液(10mM NaHCO3，0.5mMPMSM，pH7.5)研磨。研磨后的组织匀浆液经过冷冻离心机8000rpm 10分钟离心后取其上清液过ADP-Agarose分离提取层析柱。
层析反应除特别提示，整个操作过程推荐在4℃环境中进行。将拆封后取出的成品ADP-Agarose分离提取层析柱用平衡液稍做平衡，取离心后的大鼠肿瘤组织匀浆上清液与等体积的平衡液相混合直接加到ADP-Agarose层析柱上。为使匀浆上清液中的HSPPC与树脂偶联的ADP充分亲和，柱流控制在3ml/小时直至匀浆上清液全部进入柱床。
洗涤使用20倍柱床体积的含有0.5M NaCl的平衡液冲洗层析柱，柱流控制在大约1ml/分钟，然后使用平衡液充分洗涤层析柱直至流出液的紫外监测值稳定在OD280＜0.02，达到将柱中所有杂蛋白充分去除的目的。
洗脱将层析柱移至常规室温下，用洗脱液(含有3mM ADP的平衡液)浸泡柱内树脂30分钟，然后用5倍柱床体积的洗脱液洗脱与ADP分离的HSPPC。在紫外监测下收集峰内的流出液。
再次分离洗脱下的HSPPC如果体积过大需要浓缩。使用高压液相色谱仪(HPLC)进行再次分离，将HSPPC与游离的ADP分子和少量的其它未被去除的杂蛋白分离开来。收集HSPPC所在峰的流出液，经过几次HPLC的分离可得到纯度90％以上的HSPPC。
分离物的鉴定利用亲和层析的方法纯化出的HSPPC蛋白可用高效液相色谱(HPLC)或聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析洗脱产物的纯度。可用紫外分光光度法做蛋白含量的测定。采用SDS-PAGE电泳和免疫印迹试验达到蛋白定性的目的。
3、细胞液的预处理将人的肿瘤细胞株Hella细胞从培养皿上刮离连同培养液收集到离心管中，5000rpm/min离心10分钟。弃去上清液，将沉淀的细胞用平衡液温和地冲散并轻轻地冲洗然后再次离心取沉淀。收集大约湿重1克左右的细胞沉淀。
沉淀下的细胞移至塑料试管再加入5ml预冷的平衡液冲散并悬浮细胞，然后做细胞超声破碎。离心取上清液过层析柱。
层析反应在4℃环境中将细胞破碎上清液加到平衡好的ADP-Agarose分离提取层析柱上，柱的流速控制在大约2ml/小时。当上清液进入柱床与树脂充分反应后，先用含有0.5M NaCl的平衡液100ml冲洗层析柱，然后再用大量平衡液冲洗直至流出液的紫外监测吸收值稳定在OD280＜0.02。
洗脱采用竞争替代的方式洗脱与树脂偶联的ADP具有亲和力的HSPPC。在室温下用洗脱液(含有3mM ADP的平衡液)浸泡层析柱内的树脂30分钟，使得HSPPC与固相树脂偶联的ADP分离。再用5倍柱床体积的洗脱液洗脱，在紫外监测下收集峰内流出液。
再次分离将洗脱收集到的峰内流出液置于透析袋内，在4℃环境下对预冷的HPLC样品缓冲液透析3次。将透析过的溶液浓缩后用HPLC分离HSPPC和游离的ADP等成分，分离和收集HSPPC峰内流出液并做蛋白的定量和定性鉴定。
保存分离出来的HSPPC蛋白经冷冻干燥后可放置在-20℃冰箱内保存1年不影响其生物学活性。
分离物的鉴定分离纯化出的HSPPC可采用SDS-PAGE凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)和紫外分光等方法做蛋白纯度和定量的检测。采用免疫印迹法(Western Blot)做蛋白定性试验。
权利要求1.一种分离提取层析柱，其特征在于，它是由层析柱和在柱内填充的二磷酸腺苷-琼脂糖树脂两部分组合而成。
2.根据权利要求1所述的分离提取层析柱，其特征在于，所述层析柱是一种中空型管状物，其一端底部内置有允许溶液通过但阻止树脂颗粒流失的筛板。
专利摘要一种分离提取层析柱，它是由层析柱和在柱内填充的二磷酸腺苷树脂两部分组合而成。层析柱是一种中空型管状物，其一端底部内置有允许溶液通过但阻止树脂颗粒流失的筛板。层析柱内填充有功能性填料二磷酸腺苷树脂。本实用新型可从生物组织、细胞匀浆液和其它杂蛋白混合液中快速、简便、高效地提取出热休克蛋白家族中的蛋白及与HSP非共价结合的多肽分子群所形成的热休克蛋白－多肽复合体。
文档编号G01N30/00GK2727741SQ20042000436
公开日2005年9月21日 申请日期2004年2月25日 优先权日2004年2月25日
发明者韩苏, 许佐良, 张传宇 申请人:北京中天康泰生物科技有限公司